人类多能干细胞在神经管畸形发生及预防机制研究中的应用

发布时间：2019-05-24 02:37

【摘要】：研究背景神经管畸形（neural tube defects， NTDs）是最常见、最严重的出生缺陷之一。NTDs的发生是由于囊胚期神经管闭合异常所导致的神经管开放。在世界范围内，其发生率仅次于先天性心脏病，而我国的发生率为全世界最高。除致死性NTDs外，轻型闭合型NTDs不仅将给患儿带来伴随终生的先天残疾及严重的心理缺陷，也会给患儿家庭及社会带来沉重的经济负担。随着孕期叶酸（folic acid，FA）补充的推广，NTDs的流行趋势明显下降，但大规模的研究证实使用FA补充剂后仍有30-50%的NTDs无法预防。另外过量补充FA还可能引起包括新生儿胰岛素抵抗或肥胖在内的一系列非治疗作用，因此FA补充是否应当成为强制饮食添加剂，何种剂量为适宜补充剂量，在国际上引起了广泛的争议。除叶酸缺乏外，一线抗癫痫药物丙戊酸（Valproic acid，VPA）的应用也是NTDs的诱因之一。对小鼠模型的研究提示，VPA可能通过FA代谢途径导致NTDs，并且给予FA补充可能在一定程度上起到保护作用，从而避免NTDs发生。反对使用VPA的学者强调其致畸性对胎儿的严重影响，但是对于部分常见癫痫类型VPA仍然是无法替代的最佳选择。因此很难在妊娠前期或妊娠期更换其他药物，这使VPA在妊娠期的使用陷入进退两难的境地。神经管闭合这一过程始于胚胎第20天，且是贯续发生的发育过程，这使以往的观察研究遇到了很大的困难。同时由于研究对象的特殊性，特别是人类研究存在的伦理问题，使我们无法直接对人类胚胎进行在体实验。此外由于胚胎发育的不可逆性，我们亦无法获知神经管畸形的发生的真实过程，只能通过回顾性分析获得间接的证据。这就使动物模型中获得的信息无法在人类中获得验证。因此如何建立一个人类的NTDs体外研究模型，成为亟待解决的问题。本研究探索利用胚胎干细胞（ES cell）和体细胞来源的诱导多能性干细胞（iPScell）,结合体外神经系定向诱导分化技术，建立人类干细胞来源神经管研究模型。尝试通过不同组别的药物作用实验，了解FA及VPA对神经管形成及神经系发育的作用。同时在此基础上进行药物浓度筛选的初步应用研究，为在人类系统中验证动物模型中所获理论创造条件。第一部分人类多能干细胞来源神经管体外模型建立方法：对人类多能干细胞系H1；H9；iPS4进行培养传代。同时进行神经系分化：去除bFGF，，悬浮培养细胞，诱导EB形成；利用神经上皮干细胞（NSC）培养基对EB进行贴壁培养，诱导玫瑰花环样神经管结构（RS）形成,利用NSC标记物进行免疫荧光染色鉴定；利用定向诱导分化技术进行进一步分化：缺省分化大脑皮质大椎体细胞；腹侧尾侧化脊髓前脚运动神经元；神经胶质细胞系定向诱导分化；神经脊系细胞定向诱导分化；对分化获得细胞进行特异性标记物免疫荧光染色鉴定。结果：人类多能干细胞系体外培养传代后仍表达多能转录因子Oct4, Nanog；H1；H9；iPS4均能形成EB；三系均能在诱导条件下形成RS结构，且Pax6，Nestin阳性；定向诱导分化：获得前脑皮质大椎体细胞，Pax6阳性；获得人γ-氨基丁酸能神经元，GABA阳性；获得多巴胺能神经元，TH阳性；获得脊髓前脚运动神经元,ChAT阳性；获得星形胶质细胞，GFAP，S100阳性；获得神经脊细胞，P75，Sox10，SMA阳性。结论：利用三个人类多能干细胞系，通过定向诱导分化，我们首次提出建立人类干细胞来源神经管样结构模型。此模型可以在发育时间，细胞构成，分化潜能上模拟在体神经管的发育过程。它的建立为后续药物浓度筛选提供了条件，为NTDs发生及预防机制研究奠定了基础。第二部分叶酸缺乏及补充对神经管结构形成及神经发育的影响方法：利用第一部分中建立的人类多能干细胞体外神经管分化模型，选择iPS4作为研究对象，使用无FA的PRIM1640培养基作为空白对照组，根据FA梯度分组：0.02uM组，0.2uM组，2uM组，20uM组，80uM组，160uM组。在无FA的PRIM1640培养基中加入相应浓度FA，对iPS4细胞进行分化。分化过程中比较不同FA分组的：EB形成情况；EB中多能标记物Oct4，Nanog和Sox2的mRNA及蛋白质表达水平；RS形成情况；RS中NSCs标记物Pax6及Nestin的mRNA及蛋白质表达水平；远期神经分化率差别；神经胶质细胞分化率差别；神经脊细胞分化率差别。结果：FA缺乏组（0-2uM）：人类诱导多能干细胞分化EB形成率降低（P＜0.05），多能因子表达量下降；RS形成明显减少（P＜0.05）,结构紊乱；NSCs标记物Pax6，Nestin的mRNA，蛋白质表达下调；远期神经元，神经脊分化率呈剂量依赖性降低。FA补充组（20-160uM）：EB形成率升高，多能因子表达量与iPS细胞相似，RS形成数量增多（P＜0.05），神经系标记物表达量上调，远期神经元及神经脊系分化率上升。但在FA补充组中，组间差异均无统计意义。FA缺乏组及FA补充组间神经胶质细胞分化率无显著差别。结论：在人类胚胎发育过程中，FA缺乏或缺失将影响早期神经发育。FA缺乏或缺失将抑制NSCs分化，引起RS形成障碍，进而影响远期神经元及神经脊系的分化，最终导致一系列先天缺陷及综合征。对于FA代谢正常围孕期女性，补充FA使其维持在正常或稍高水平（20uM-80uM，即常规富含FA饮食或400ug/day补充剂量）将有利于神经分化及神经管的形成，而无需给予更高剂量FA（160uM或600ug/day），带来不必要的非治疗作用。第三部分VPA及叶酸对神经系发育的影响及其相互作用方法：利用第一部分中建立的人类多能干细胞体外神经管分化模型，选择iPS4作为研究对象，使用DMEM/F12+N2培养基作为空白对照组，实验分组：VPA组（1mM VPA），VPA+FA组（1mM VPA+160uM FA）。对不同处理组别的iPS细胞进行神经分化，分化过程中比较不同分组的： RS形成情况；RS中NSCs标记物的mRNA及蛋白质表达水平；NSCs殖及凋亡情况；NSCs细胞周期；FA受体Forl在mRNA及蛋白质水平的表达情况；及远期神经分化率差别。结果：与对照组相比，VPA处理组：RS形成明显减少（P＜0.01）,结构紊乱；NSCs标记物Pax6，Nestin的mRNA，蛋白质表达下调（P＜0.001）；NSCs增殖减少(41.01±3.53%VS.80.09±4.1%，P＜0.01）；凋亡显著增多（21.38%VS.3.71%，P＜0.01），凋亡早期细胞亦增高（29.64%VS.9.76%，P＜0.05）；处于G2-S期细胞比例下降（34.75%VS.63.67%，P＜0.05），G0-G1期细胞增多（65.25%vs.36.33%，P＜0.05）；FA受体Forl mRNA及蛋白质表达量下调；远期神经元分化率降低。VPA+FA组：RS形成较VPA单独处理组增多,但较对照组仍减少（P＜0.05），但RS结构较对照无明显差别；NSCs标记物Pax6，Nestin mRNA，蛋白质表达较VPA组明显升高（P＜0.01），与对照组差异无统计学意义；NSCs增殖较VPA单独处理组高，但仍低于对照（58.0±4.67%VS.80.09±4.1%，P＜0.05）；与VPA单药组相比，凋亡稍降低，但差别不具有统计学意义，与对照组相比，细胞死亡多（15.46%VS.3.71%，P＜0.01），但凋亡早期细胞比例无明显差别（9.76%VS.9.86%，P＞0.05）；与VPA单独处理组相比，处于G2-S期细胞比例增多(43.35%VS.34.75%)，G0/G1期的细胞比例减少（56.65%VS.65.25%），但与对照组相比，G0-G1期细胞仍高（56.651%VS.36.34%，P＜0.05）；FA受体Forl的mRNA及蛋白质表达量下调；与对照相比，远期神经元分化率仍降低。结论：结果证实治疗剂量的VPA抑制人类多能干细胞的体外神经分化。其通过抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻碍FA代谢，破坏正常神经管样结构的形成，导致NTDs的发生，同时影响远期神经分化。补充FA实验组证明FA在其他致畸诱因的存在下，可以在一定程度上保护早期神经胚发育，弥补细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进FA代谢，但与对照相比仍存在一定异常。这为解决临床治疗存在的矛盾提供了新的研究平台，在药物筛选中有着一定的应用前景。创新点与小结本课题首次将人类多能干细胞体外神经管分化模型应用于出生缺陷—NTDs的研究。在建立人类干细胞来源神经管体外模型的基础上，进行了FA浓度筛选及VPA处理等药物筛选的初步应用研究。首次在人类分化发育系统中验证了动物模型中所获得的理论；为后续制备患者个体化神经管分化模型，研究NTDs发病机制，致病基因筛选，优化预防配方奠定了基础；在提高人口质量，最终避免NTDs发生的道路上，迈出了新的一步。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R748

【共引文献】