髓系抑制细胞（MDSC）和mTOR信号通路在哮喘发生中的作用机制研究

发布时间：2019-07-09 17:06

【摘要】：研究背景MDSC(Myeloid derived suppressor cell)是髓系来源的免疫抑制细胞,在急慢性炎症、肿瘤及重症感染等疾病中MDSC明显增多,且负向调节机体免疫功能。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase)/蛋白激酶B(protein kinase B)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin)/p70S6k(简称m TOR)信号通路,主要调控细胞的生长分化,其还可改变下游效应分子的活化状态,影响细胞凋亡、增殖、血管生成及转化,参与核糖体合成、基因转录、蛋白质翻译、细胞凋亡和生长。研究发现多种疾病的发生及发展与m TOR号通路的改变相关,其非常有希望成为治疗新靶点。支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性炎症性疾病,已经严重危害了儿童的身心健康,并且70%-80%的儿童发病年龄小于5岁,如果不能及时的明确诊断并给予有效治疗治,将会随着病程的延长产生气道重塑,从而失去最佳的治疗时机,对孩子伤害更大。MDSC及m TOR信号通路已广泛应用于肿瘤的研究及临床治疗中,而在哮喘中的研究较少,且在哮喘发病中发病机制未明确,此外,二者是否共同在哮喘中起作用及如何作用尚未见报道。鉴于此,我们将分三部分研究二者在哮喘中的作用及机制。第一部分内源、外源MDSC引起Th1/Th2失衡在哮喘发生中的作用及机制研究目的探讨内源、外源MDSC与Th1/Th2失衡在哮喘发生中的分子机制。材料和方法为了研究内源MDSC在哮喘发生中的作用,通过临床研究设哮喘组、干预组与对照组,ELISA检测各组外周血清IL-10、IL-12水平,流式细胞检测外周血MDSC比例,并分析MDSC与IL-10、IL-12的相关性;同时建立动物实验模型,设哮喘组、干预组及对照组,HE、PAS染色观察各组气道炎症,免疫组化染色观察各组MDSC、IL-10及IL-12水平;为了探讨外源MDSC在哮喘中的抑制作用,建立大肠癌小鼠模型,标记并提取MDSC,注入哮喘小鼠模型中,分为对照组,哮喘组,干预组及移植组,观察各组哮喘气道重塑的表达,检测各组血清及BALF中IL-10及IL-12水平,分析移植组MDSC与IL-10,MDSC与IL-12的相关性。结果1.哮喘发作组血清MDSC与IL-10水平均显著升高,且两者呈正相关,发作组的IL-12水平显著下降,MDSC与IL-12呈负相关。(1)发作组较缓解组、肺炎组及对照组外周血单个核细胞MDSC比例及血清IL-10水平均显著升高(p0.05);后三组血清IL-10水平及外周血单个核细胞MDSC比例均无显著差异(p0.05);(2)发作组患儿血清IL-12水平较缓解组、肺炎组及对照组显著降低(p0.05);后三组血清IL-12水平无显著差异(p0.05);(3)发作组患儿血清IL-10与外周血单个核细胞MDSC比例呈正相关、IL-12与MDSC呈负相关。2.哮喘组小鼠气道炎症、气道重塑显著,肺组织MDSC及IL-10水平均显著升高,IL-12水平显著下降。(1)哮喘组小鼠HE及PAS染色较对照组相比,均表现明显的气道重塑,干预后气道重塑明显改善;(2)哮喘组小鼠肺组织IL-10及MDSC均显著高于对照组,布地奈德干预后显著下降(p均0.05),哮喘组小鼠IL-12水平显著低于对照组,布地奈德干预后显著上升(p0.05)。3.从骨髓细胞悬液中可提取较高比例的MDSC,外源MDSC移植入哮喘小鼠后气道重塑显著改善,肺组织MDSC及IL-10水平显著下降,且两者呈正相关,IL-12水平干预后显著上升,且与MDSC呈负相关。(1)制作大肠癌小鼠模型,骨髓细胞悬液中分离提取外源性MDSC比例为86.3%,显著高于脾脏提取的56.2%;(2)外源MDSC移植入哮喘小鼠后,气道炎症、气道重塑显著改善,与干预组相比无显著差别;(3)用免疫组化染色方法发现哮喘组MDSC呈高表达,移植后呈低表达;ELISA检测哮喘组血清及BALF中IL-10升高、IL-12下降,移植后IL-10下降、IL-12升高,移植组IL-10与MDSC呈正相关、IL-12与MDSC呈负相关。结论内源MDSC增高时IL-10升高、IL-12降低,导致Th1/Th2失衡与哮喘发生相关;外源MDSC可使IL-10降低、IL-12升高,纠正Th1/Th2失衡从而抑制哮喘。第二部分m TOR信号通路引起Th17/Treg失衡在哮喘中的作用及机制研究目的验证m TOR信号通路是否通过诱发Th17/Treg失衡从而在哮喘发生时起诱导作用,抑制通路的各个靶点是否通过纠正Th17/Treg失衡在哮喘发生时起抑制作用,比对不同的抑制剂应用后各个靶点水平。材料与方法临床研究设哮喘重度发作组、轻度发作组及缓解组、肺炎组及正常对照组,用ELISA分别测定各组血清的m TOR,IL-17及TGF-β水平;动物实验设生理盐水对照组、卵蛋白哮喘组、布地奈德干预组,m TOR抑制剂(雷帕霉素)干预组,PI3K抑制剂(LY294002)干预组,Akt抑制剂(曲西立滨)干预组,各组分别应用HE染色、PAS染色,各组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR及p-p70S6K行免疫组织化学染色及Western blot检测;分别用ELISA检测BALF及血清中的IL-17及TGF-β水平。结果1.哮喘重度发作组较其余各组相比,血清中的m TOR及IL-17显著升高,TGF-β显著下降;m TOR与IL-17呈正相关,与TGF-β呈负相关;其余各组之间m TOR、IL-17及TGF-β水平无显著差别;2.m TOR信号通路在哮喘发生时被激活,气道重塑明显,缓解时气道重塑明显改善;3.哮喘发作时免疫组化及Western blot检测p-PI3K、p-Akt、p-m TOR及p-p70S6K水平均升高,干预后各指标均显著降低;4.p-PI3K表达水平在曲西立滨干预组显著高于哮喘组,哮喘组又显著高于其余各组;p-Akt在雷帕霉素干预组显著高于哮喘组,哮喘组又显著高于其余各组;p-m TOR及p-p70S6k的表达水平在哮喘组均显著高于其余各组;5.哮喘发生时小鼠BALF及血清IL-17升高、TGF-β降低,哮喘缓解时BALF及血清IL-17降低、TGF-β升高。结论m TOR信号通路激活时可引起IL-17升高、TGF-β降低,从而导致Th17/Treg失衡在哮喘发生时起诱导作用;相反,哮喘缓解时m TOR信号通路被抑制,血清IL-17降低、TGF-β升高,Th17/Treg失衡被纠正;通路各个靶点水平在各个靶点抑制剂应用后比对有差异。第三部分MDSC、m TOR信号通路通过i NOS及NO在哮喘的发生中相互作用目的验证MDSC、m TOR信号通路是否通过i NOS及NO在哮喘的发生中相互作用。材料和方法生理盐水对照组,卵蛋白哮喘组,布地奈德干预组,检测各组i NOSm RNA及NO表达;哮喘组小鼠p-m TOR及p-p70S6K水平在外源MDSC注入前后的变化,注入前后i NOS及NO水平的变化,哮喘小鼠中用i NOS抑制剂(L-硝基精氨酸L-nitro-arginine LNA)注入前后p-m TOR及p-p70S6K水平变化;哮喘小鼠m TOR抑制剂(雷帕霉素)应用后内源MDSC、i NOS及NO的水平变化,用LNA注入哮喘小鼠中测定注入前后内源MDSC水平的变化(各组i NOS及NO水平用ELISA检测,各组p-m TOR及p-p70S6K用免疫组化染色及Western blot检测);ELISA测定哮喘组血清m TOR及i NOS水平,用免疫组化测检肺组织中MDSC水平,pearson直线相关分析其中两两的相关性。结果1.i NOS及NO水平在哮喘组显著高于对照组、干预后显著下降。2.哮喘组小鼠外源MDSC注入后p-m TOR、p-p70S6K,i NOS及NO水平均较注入前下降;LNA注入哮喘小鼠后p-m TOR及p-p70S6K水平均下降。3.雷帕霉素注入哮喘小鼠后内源MDSC水平,i NOS及NO水平均较注入前下降;LNA注入哮喘小鼠后内源MDSC水平均下降。4.ELISA测定哮喘组血清m TOR及i NOS水平,用免疫组化测肺组织中MDSC水平、pearson直线相关分析三者相关性,其中两两均呈正相关。结论雷帕霉素抑制了哮喘小鼠内源MDSC的表达,是通过抑制i NOS及NO的表达而实现的;外源MDSC下调了m TOR的表达,是通过抑制i NOS及NO的表达而实现的。
文内图片：
图片说明：A各组单个核细胞MDSC，，血清IL-10，IL-12，IgE及EOS计数
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.6


本文编号：2512296