巴马香猪ENU诱变建立两个遗传性出生缺陷模型家系的研究

发布时间：2019-08-19 08:35

【摘要】：研究背景出生缺陷(birth defects,BD)是指由于遗传或环境的因素影响了胚胎或胎儿的正常发育,出生后表现出的身体结构的缺陷或功能障碍,往往造成患儿的致病、致残、致畸或致死。近几十年来,随着医学的不断进步,全社会生育医疗保健水平和卫生状况有了很大的提高,相对于其他致死因素,出生缺陷已成为婴幼儿死亡的主要原因。我国每年的出生人口总数为1000多万,其中4%~6%的婴幼儿患有出生缺陷。出生缺陷已严重影响到我国出生人口的质量,已成为我国重大公共卫生问题。遗传和环境因素的作用是导致出生缺陷发生的主要原因。一般认为,出生缺陷中20%~30%是由单纯遗传因素导致的,5%~10%是由单纯环境因素造成的,而60%~70%则是由遗传和环境因素交互作用的结果。因此,遗传因素以很大的比例影响出生缺陷的发生。在人类自身研究出生缺陷疾病受到伦理,研究周期长等很多方面因素的制约,目前大部分出生缺陷发生的分子遗传机理及作用机制仍不清楚。因此,动物模型仍是研究各种出生缺陷发生机制的有效材料。乙烷亚硝甚脲(ethylnitrosourea,ENU)是一种强有力的化学诱变剂,主要诱发单碱基发生突变,通过对动物进行ENU诱变筛选可以获得很多由基因突变导致的疾病表型,从而为人类医学研究提供相应的遗传性疾病动物模型。研究表明,ENU对小鼠的突变效率高达0.2%,而且这种突变是随机的,不具有任何的倾向性,与以基因敲除为代表的典型的基因驱动法相比,规模更大、速度更快、挖掘基因的力度更高。采用这种高效的随机诱变方法对生长周期短的多胎动物进行诱变,有望在短时间内获得数量可观的突变个体,我们可以通过表型筛选以获得我们感兴趣的突变类型。ENU人工诱变已经在果蝇、斑马鱼、小鼠等动物中被证明是一种发现新的功能基因的有效方法,但在大动物上进行人工诱变以创造新的基因资源在国际上仍属空白。猪的基因组相比小鼠基因组更接近于人类,通过人工诱变我们可以寻找到一些在小鼠中难以发现的人类遗传性疾病相关的基因。建立巴马香猪enu诱变筛选突变表型的技术体系;通过表型鉴定重点筛查出生缺陷表型并建立稳定遗传的家系,为研究相应的人类出生缺陷疾病的作用机制提供稳定可靠的动物模型及相关材料。材料与方法1.巴马香猪enu诱变挑选4-12月龄成年健康巴马公猪81头,按不同的enu剂量分为7组:45mg/kg组,4头;65mg/kg组,9头;75mg/kg,11头;85mg/kg,35头;90mg/kg,11头;95mg/kg,7头;105mg/kg,4头。enu采用耳静脉滴注,每头公猪按相应剂量共注射3次,每周一次,连续三周。注射诱变剂后每隔1周人工采集公猪精液监测其精液品质,待精液活力恢复至30%以上,诱变公猪作为f0代与野生型母猪配种,产生f1代个体。从诱变f0公猪中挑选了两个诱变家系(包括f0父母和5头f1后代,家系ienu注射量为65mg/kg,家系iienu注射量为85mg/kg),采用简化基因组测序法(restrictionsiteassociateddnasequencing,rad-seq)对其enu引入的突变及其频率进行分析和评估。对出生的f1代进行表型鉴定,重点筛查出生缺陷突变表型。对存活至成年的突变f1代公猪(或母猪),以野生型母猪(或公猪)与之交配,对其出生的f2代进行表型鉴定,若出现与f1代突变表型相同的性状,进一步按显性家系建系扩繁;若突变表型在f2代未能遗传,则按隐性家系建立方案进行建系工作。同时选留一定数量无突变表型的f1公猪直接建立隐性家系:f1公猪与野生型母猪交配后在其f2代中选留4头以上母猪再与f1公猪回交,对出生的f3代进行表型鉴定重点筛选出生缺陷突变表型。2.巴马香猪enu诱变获得腹股沟疝伴发先心病模型家系的建立与研究对获得的突变家系进行详细准确的表型鉴定:对腹股沟疝表型进行多次外观鉴定,并结合手术解剖加以确认;详细记录患病猪只腹股沟疝发生的部位、大小、类型及其并发症。结合家系系谱图,按患病个体发生的比例分析该家系腹股沟疝可能的遗传模式。以illumiina60k猪snp芯片对该家系猪只进行全基因组扫描分析,确定腹股沟疝可能的易感位点,通过生物信息学方法查找分析易感位点附近的基因,设定易感候选基因后进行外显子测序。对家系内所有f3代猪进行血液生理生化指标检测,心电图、b超等临床特征检查以获得与腹股沟疝发病相关的详细的临床基础数据。对患猪手术过程中切取的疝环组织及疝囊组织作病理切片及免疫组化分析。结合心电图、b超及心脏解剖判定结果,统计分析该家系腹股沟疝与先心病发病的关联性。3.巴马香猪enu诱变获得白化合并生长迟缓及后肢瘫痪复合疾病家系的建立与研究目的研究分别对白化、生长迟缓及后肢瘫痪疾病表型进行遗传学分析,通过候选基因外显子直接测序的方法对家系成员分别进行白化、生长迟缓及后肢瘫痪相关致病基因进行突变检测分析。结果1.巴马香猪enu诱变1.1诱变公猪恢复及配种繁殖情况:enu诱变处理后,公猪无精期时间随剂量升高而增加,但不完全一致,存在个体差异;精液质量恢复率(精子活率恢复至70%以上,密度107个/ml)随剂量升高而增加,但不完全一致,存在个体差异,高剂量个体部分无法恢复生育能力;诱变恢复后的公猪各剂量组间繁殖性能(返情率、妊娠率、平均窝产仔数)无明显差异,原因可能受季节、受配母猪、统计误差等多种因素的影响。1.2f1代enu引入突变分析:f1代enu引入突变的平均频率在65mg/kg和85mg/kg剂量分别为1.63×10-6和5.86×10-6;突变类型主要为g-a类型的突变,且总体上转换类型的突变占71.2%;突变分布符合基因组组成比例,即大量的enu引入的突变分布在intergenic区域(基因间区)和内含子区域,编码区由于在基因组中所占比例较少,因此诱变产生的突变相应地较少。1.3诱变家系组建及突变体筛选:f1代筛选到突变体126个,出生缺陷包括脚趾畸形、短尾、腹壁缺损、弯尾、四肢发育异常、颅骨发育不全、脑膨出、歪鼻等,其中大部分为致死性。我们对其中51头存活至成年的突变个体进行了建系验证其遗传性,除2头白化个体遗传外,其余均无遗传。在已完成建系的11个隐性家系中发现7个家系具有突变表型,其中6个家系均表现为腹股沟疝,另1个家系为毛色白化合并生长迟缓表型。2.巴马香猪enu诱变获得腹股沟疝模型家系的建立与研究2.1腹股沟疝遗传模式分析:获得的腹股沟疝大家系其腹股沟疝为限性性状,f3代发病率为65%,远远高于单基因隐性遗传理论百分比的25%,其遗传模式较为复杂,目前无法明确,有待进一步研究。2.2illumiina60k猪snp芯片全基因组扫描发现在第10号染色体第10138848bp处有一个强的信号位点(p=0.00022)。2.3以spata17为候选基因进行的外显子测序,未找到与腹股沟疝表型相符合的突变。2.4病理切片显示腹股沟疝患猪腹环周围肌肉组织出现肌肉萎缩,肌纤维组织间质炎性细胞浸润,血管淤血,神经纤维变性,肌肉组织间脂肪组织营养不良等病理变化;透射电镜观察发现患病猪只疝囊组织中胶原纤维出现变性、萎缩、断裂及降解等病变;免疫组化分析发现患病猪只疝囊组织中Ⅰ型胶原含量及Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原含量的比例均低于正常猪对应部位腹横筋膜中的含量(p0.05),而Ⅲ型胶原含量则高于正常猪(p0.05),Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量总和在两组中无统计学差异(p0.05)。2.5先心病发病率在f3代疝气猪中高达20.6%,在总的公猪中为13.5%,非疝气公猪中未检测出先心病;尽管母猪不患疝气,但先心病患病率为16.3%,与家系f3代群体总发病率(14.9%)及f3代总体公猪中先心病患病率接近。3.巴马香猪enu诱变获得白化合并生长迟缓及后肢瘫痪复合疾病表型家系的建立与研究3.1针对f3代白化表型进行的mc1r候选基因外显子测序发现突变个体在该基因第894位碱基处插入了cc两个碱基。3.2针对生长迟缓性状进行的mc3r及mc4r候选基因外显子测序未发现与表型相符合的突变。3.3针对f4代后肢瘫痪表型进行的smn1候选基因外显子测序未发现该基因有突变。结论1本课题首次在大型实验动物巴马香猪上成功建立了enu诱变体系,探索并确定了小型猪enu诱变合适的剂量和方法,证实了enu诱变体系在小型猪上应用的可行性。2本研究获得了大量出生缺陷突变表型,但大部分未能遗传,原因可能是大多数出生缺陷为致死性或为多基因遗传控制。3通过巴马香猪enu诱变建立了能稳定遗传的腹股沟疝伴发先心病的大动物模型家系,研究表明腹股沟疝与先心病存在很大的相关性,其发病机制可能与胶原代谢异常有关;尽管其遗传模式仍不明确,确切的分子遗传机制也需进一步研究,但该家系的获得和建立可为人腹股沟疝病理机制及先心病的研究提供稳定可靠的动物模型和研究材料。4获得并建立了白化合并生长迟缓及后肢瘫痪复合疾病家系。其中白化性状为mc1r基因第894碱基处插入cc两个碱基引发的突变导致。该插入突变并不符合enu诱变以单碱基颠换或转换为主的单碱基点突变类型,提示研究纳入的巴马香猪群体本身就可能携带MC1R基因的隐性突变。同时,通过查阅文献表明,我们在这一隐性白化巴马香猪发现的MC1R基因的插入突变为猪MC1R基因的一个新突变。生长迟缓性状及后肢瘫痪性状尚未鉴定到致病基因,加上F1代突变公猪的脚趾畸形性状并未能遗传,提示ENU诱变可能在该家系基因组上诱发了多位点的单碱基突变。5综上,巴马香猪ENU诱变是获得人类出生缺陷模型的有效手段,可为研究人类遗传性出生缺陷疾病复杂的病理机制提供稳定遗传的模型家系和研究材料。
【图文】：

突变频率,模式分析,诱变,家系

图 1-1 ENU 诱变引入突变频率及模式分析。两个家系用于突变频率分析，其中家系 I ENU 注射量为 65mg/kg，，而家系 II ENU 注射mg/kg。通过 RAD 测序分析，检测仅存在于 F1 后代基因中的突变，认为此类突变应为 EN。B，分析显示 ENU 引入突变类型主要为 G-A 类型的突变，且总体上转换类型的突变占 7C），此外突变分布符合基因组组成比例，即大量的 ENU 引入的突变分布在 intergenic 区域

突变体,表型

F1中发现的多种突变体表型
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.9

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