儿童系统性红斑狼疮基因组甲基化水平及LINE-1序列甲基化水平的研究

发布时间：2019-08-26 20:10

【摘要】：研究目的：探讨儿童系统性红斑狼疮(pediatric systemic lupus erythematosus, pSLE)患者基因组DNA甲基化水平在发病过程中的变化、LINE-1序列甲基化水平的变化及其与病情活动度、补体C3及血浆同型半胱氨酸的相关性。研究方法：一、对象为2010-2012年在我院风湿免疫科确诊的pSLE患儿。选取pSLE患儿外周血单个核细胞的DNA标本为病例组,同期采集健康查体儿童DNA标本为对照组。SLEDAI≥10分为疾病活动组,10分为相对静止组；按年龄分为12岁和≥12岁组。取100ng DNA标本,加入0.25U Benzonase核酸酶,0.3 mU磷酸二酯酶I和0.2 U碱磷酸酶,用Tris缓冲液控制pH值在7.9,37℃水解6小时。利用Agilent1200-6410B液相色谱-串联质谱仪和Agilent ZORBAX SB-AQ C18 (2.1×50 mm,3.5肛)色谱柱对水解后样品分离定量。优化方法在5 min内完成一份样品检测,并行方法的日内稳定和日间稳定性评价,证明方法稳定可靠。实际样品进样量为10此,检测模式为MRM模式。测定5mdC和dG的峰面积比。以dG为内标,用标准曲线计算标本中DNA总体甲基化水平。二、通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)联合RNA碱基特异性剪切法(MassCLEAVE)测定外周血单个核细胞中LINE-1甲基化水平,以及应用化学发光法测定血浆总同型半胱氨酸(tHcy)水平。研究结果：一、病例组38例,男女比8:30,年龄4-18岁,对照组30例,男女比11：19,年龄8-18岁。病例组12岁16例,≥12岁22例；对照组12岁28例,≥12岁2例。SLEDAI≥10分12例,SLEDAI10分26例。病例组基因组DNA甲基化水平(5.89%±0.41%)低于对照组(6.75±0.79%),差异有统计学意义(t=-5.613,P0.001)。病例组按12岁组与≥12岁组组间比较,其基因组DNA甲基化水平差异无统计学意义,对照组依同样方法分组比较,组间甲基化水平无明显差异。分别比较两组中男女间甲基化水平,差异无统计学意义(P0.05)。SLEDAI10分和SLEDAI≥10分组分别与对照组比较,甲基化水平均存在差异(p0.001);SLEDAI10分和≥10分组之间差异无统计学意义(p=0.993)。二、病例组59例,男女比16:43,年龄4-18岁,对照组47例,男女比16:31；年龄6-18岁。pSLE病例组及健康对照组的LINE-1甲基化水平分别为60.93%及62.88%,二者比较差异显著(p=0.001)。病例组LINE-1甲基化水平与SLEDAI评分相关(r=-0.285,P=0.032)。病例组LINE-1甲基化水平与C3显著相关(r=0.317,P=0.044)。低甲基化水平者pSLE发病风险升高(AOR:14.5; 95% CI:2.8,75.6)。病例组血浆同型半胱氨酸水平显著高于对照组,(分别为15. 11μmol/L及11.022μmol/L, P= 0.028), LINE-1甲基化与血浆同型半胱氨酸显著相关(r=-0.4,P=0.013)。结论：pSLE患者基因组DNA甲基化水平降低,LINE-1序列甲基化水平降低,LINE-1甲基化水平与pSLE病情活动度及补体C3显著相关,与血浆同型半胱氨酸水平显著相关。
【图文】：

图３所示，５ｍｄＣ的ＬＯＤ和逡逑ＬＯＱ分别为１ｘ１０－ｉ７Ｍ，，ＩｘｌＯ－ｉＳＭ

６０．０４％、６１．６７％、６２．８８％，Ｐ＝０．００１）。中重度活动狼疮与缓解及轻度活动狼疮ＬＩＮＥ－逡逑１甲基化水平相比，差异显著（Ｐ＝０．０３）。（表４）评估位于ＬＩＮＥ－１的每一个坤Ｇ位逡逑点的甲基化水平，（图２），不同ＣｐＧ位点甲基化水平不同，ＣｐＧ－５位点甲基化水平逡逑最低（２０．６３％），相反，位于５１尾端的ＣｐＧ－１１、ＣｐＧ－１２位点则甲基化水平最高逡逑（８５．５４％）。ＣｐＧ－ｌ，２，５位点甲基化水平明湿低于健康对照姐（Ｐ＜０．０５）。依据病情活逡逑动性分析，将ＬＩＮＥ－１上每一个ＣｐＧ位点的甲基化水平进行比较，中重度活动狼疮逡逑ＣｐＧ－ｌ，２，５甲基化水平显著低于缓解及哲度活动狼疮（分别Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。逡逑表４．不同疾病活动度病例组与对照组ＬＩＮＥ－１甲基化水平比较逡逑ｎ逦ＬＩＮＥ－１甲基化水平（％）邋Ｐ逡逑中重度活动邋ｐＳＬＥ逦２８逦６０．０４±２．６７逦０．００１＊逡逑缓解及轻度活动邋ｐＳＬＥ逦２８逦６１．６７±３．１３逦０．００１２逡逑病例组逦５６＊逦６０．８５巧．００逦０．００１３逡逑对照组逦４７逦化８８±２．７６逡逑１：中重度活动ｐＳＬＥ与对照组相比差异显著逡逑２：缓解及容度活动ｐＳＬＥ与对照}D相比差异显著逡逑３：病例组与对照组相比差异显著逡逑＊３个病例无实验结果逡逑２５逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R725.9

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本文编号：2529519