神经肽P物质对95%氧致AECⅡ细胞损伤的氧化抗氧化作用及Wnt信号通路的相关研究

发布时间：2020-02-17 14:49

【摘要】：第一部分神经肽P物质对95%氧致AECⅡ细胞损伤的氧化抗氧化作用背景在新出生的早产儿中，由于机械通气反复过度扩张肺泡和肺泡导管，吸入高浓度氧气产生大量ROS，从而引起肺氧化应激性损伤。肺泡上皮细胞是氧化应激性损伤的主要作用位点，由于肺泡型上皮细胞（AEC）已经高度分化，失去再生能力,因此肺泡上皮的修复完全依靠肺泡型上皮细胞（AECⅡ）的增殖转分化，而高氧暴露会抑制AECⅡ细胞的增殖，促进AECⅡ细胞凋亡，导致肺损伤修复困难或出现纤维化等异常修复。神经肽P物质（SP）是由多个氨基酸组成的感觉神经肽，具有广泛的生物学作用。有研究发现，SP在心肌缺血、烧伤等引起的肺损伤中会引起气道炎症反应，但亦有研究发现，SP可刺激上皮细胞生长因子及受体表达，调控表皮干细胞迁移、分化，进而促进上皮损伤修复。但目前，SP在高氧肺损伤中的氧化及抗氧化作用鲜有报道。目的（1）采用改良后的差异贴壁法分离培养19d早产鼠AECⅡ并鉴定，为后续建立SP干预细胞氧化损伤模型奠定基础。（2）研究SP干预对高氧暴露下AECⅡ细胞的影响，探讨SP在高氧肺损伤中氧化及抗氧化的作用。方法分离培养、纯化SPF区孕19d大鼠的AECⅡ，经改良巴氏染色鉴定细胞纯度，透射电镜鉴定细胞后，放入细胞培养箱内继续培养24h后，按照随机分组原则分为：1、空气组：细胞放入培养箱中，其中氧体积分数为21%（21%浓度氧）；2、高氧组：细胞放入含有95%O_2和5%CO_2的混合气体的密闭氧仓中；3、高氧SP组：细胞培养液中预先加入5×10~(-8)mol/L的SP，再行高氧处理；4、高氧SP受体拮抗剂组：细胞培养液中预先加入5×10~(-8)mol/L SP和5×10~(-7)mol/LSP受体拮抗剂L703.606，其余处理同高氧组。各组细胞均置于5%CO_2培养箱继续培养24h。（1）光学显微镜观察细胞的生长状况。（2）激光共聚焦显微镜观察各组细胞的超氧化物阴离子水平表达情况。（3）流式细胞仪检测各组细胞内线粒体膜电位水平。（4）通过流式细胞仪检测细胞周期。（5）化学比色法测定各组细胞内MDA、TAOC、SOD含量。结果与空气组比较，高氧组暴露24h，倒置显微镜下观察AECⅡ明显收缩，细胞间隙增大，部分细胞脱壁，细胞存活率和线粒体膜电位水平明显下降， ROS含量明显增加，超氧化物阴离子水平和凋亡率明显升高（P＜0.05）。进一步检测细胞氧化损伤指标可见细胞内MDA水平升高，而TAOC、SOD含量下降（P＜0.05）。SP干预后与高氧组比较形态学观察可见细胞外形与空气组接近，细胞收缩减轻，存活率和线粒体膜电位水平明显升高，ROS含量明显减少，超氧化物阴离子水平和凋亡率明显下降，氧化损伤指标MDA水平下降，而TAOC、SOD含量升高（P＜0.05）。但是，L703.606干预后SP的氧化抗氧化作用明显降低，细胞氧化损伤与SP干预处理组比较明显增加（P＜0.05）。结论 SP干预后可显著降低高氧暴露下AECⅡ的凋亡，改善高氧对AECⅡ的增殖抑制，减轻高氧对AECⅡ的氧化损伤，增强细胞的抗氧化能力。SP对高氧致AECⅡ损伤的保护作用同改善AECⅡ氧化/抗氧化失衡有关。第二部分Wnt信号在神经肽P物质对95%氧致AECⅡ细胞氧化抗氧化作用的机制研究背景 Wnt信号通路是一种非常经典的信号转导通路，在各种生物体内发挥重要作用，可以调控胚胎生长发育、细胞增殖分化及凋亡等。很多疾病的发病机制都与Wnt信号通路的失活有关。其中Wnt经典信号通路在肺发育、肺泡上皮细胞的增殖分化以及肺的空间构象形成中发挥重要作用。当Wnt信号被激活时，Wnt蛋白与Dally、FRPs蛋白结合，该蛋白复合体与细胞表面受体Frizzled/LRP结合，引起细胞胞浆内β-catenin积聚，转移入核内，调控下游靶基因的表达。前一部分已经证明SP干预后可显著减轻高氧对AECⅡ的氧化损伤，增强细胞的抗氧化能力。SP对高氧致AECⅡ损伤的保护作用同改善AECⅡ氧化/抗氧化失衡有关。然而SP是否通过激活Wnt经典信号通路发挥氧化抗氧化作用，目前国内外无相关研究报道。本实验部分主要探讨AECⅡ细胞核内Wnt经典信号通路在空气、高氧环境及SP、SP受体拮抗剂干预后的表达情况，进一步探讨BPD的发病机制。目的探讨SP干预对高氧暴露下AECⅡ的氧化抗氧化作用是否与活化Wnt经典信号通路有关，观察该信号通路中Wnt7b和β-catenin信号分子的变化。方法 (1)分离培养孕19d的早产鼠AECⅡ细胞并建立细胞氧化损伤模型。 (2)RT-PCR检测高氧暴露及SP干预后细胞内Wnt信号通路中Wnt7b和β-catenin基因表达水平。 (3)Western Blot检测高氧暴露及SP干预后细胞内Wnt信号通路中Wnt7b和β-catenin蛋白表达水平。结果高氧暴露24小时后，AECⅡ内Wnt7b和β-catenin信号分子的mRNA和蛋白表达水平明显减弱，与空气组比较有显著性差异（P＜0.05）。而高氧暴露前给予SP干预后，Wnt7b和β-catenin的mRNA和蛋白水平有所增加（P＜0.05），，表明SP可激活Wnt经典信号通路。而SP拮抗剂L703.606干预后，Wnt7b和β-catenin的mRNA和蛋白水平均有所下降（P＜0.05），表明Wnt经典信号通路的激活可被抑制。结论高氧暴露后AECⅡ内Wnt经典信号通路发生了变化， SP对细胞损伤的氧化抗氧化作用可能与激活Wnt经典信号通路有关。
【图文】：

细胞形态,巴氏染色,电镜观察

电镜观察,巴氏染色,细胞形态

图 1.1：光学显微镜观察 AECⅡ细胞形态图 1.2：电镜观察 AECⅡ形态Fig1.1: Cell morphology of AECⅡ(×200)Fig1.2: AEC Ⅱmorphou by Electron（×8000）图 1.3：改良巴氏染色 (×400)Fig1.3：Modified Papanicolaou stain forstaining inclusions in AECⅡ cells (×400)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.6

【参考文献】