WAS综合征特异性无整合诱导性多能干细胞体外造血分化及基因靶向编辑研究

发布时间：2020-02-22 23:57

【摘要】：细胞重编程技术的重大突破为研究人类发育和疾病搭建了新的体外平台,更为个体化细胞治疗提供了新的策略,是发育生物学领域的巨大革新。解决安全性问题是重编程细胞走向临床应用的前提和关键。本研究利用游离型载体技术将WAS综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome, WAS)患者的成纤维细胞重编程为安全的无整合诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSCs)。这些WAS特异性iPSCs可在体外诱导分化为血液细胞,并显示疾病相关表型,因此可作为WAS的体外研究平台。更为重要的是,我们对TALEN介导的WAS基因同源重组策略进行了优化,可对iPSCs基因组高效编辑,从而得到纠正WAS基因的患者特异性iPSCs本研究将为再生医学替代细胞iPSCs的安全获得和安全基因操作提供典范。 第一章WAS综合征特异性无整合诱导性多能干细胞株的建立和鉴定 WAS综合征是由WAS基因发生功能缺失型突变所导致的x染色体连锁的免疫缺陷病。WAS蛋白在血液细胞中特异性表达并介导Actin多聚化,是维持正常免疫系统功能不可或缺的重要因子。为建立WAS综合征的体外研究模型,我们利用表达OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和TP53shRNA的游离型载体重编程WAS综合征患者成纤维细胞。我们所建立的WAS综合征特异性iPSCs (WAS-iPSCs)在形态学与基因表达模式上均与正常人胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)相似,且表达完全重编程特异性标志Tra-1-60和Tra-1-81。PCR分析和基因测序结果显示这些WAS-iPSC克隆不含任何重编程载体DNA残留,且均携带患者WAS基因突变,为安全无整合的iPSCs,可用作体外疾病模拟及后续基因操作。 第二章WAS-iPSCs体外造血分化及疾病表型鉴定 iPSCs的体外定向分化为研究正常生理发育及疾病进展创造了体外研究平台。为了证实WAS综合征疾病相关表型可在体外模拟,我们利用基质细胞共培养法诱导WAS-iPSCs造血分化。在GM-CSF和M-CSF的作用下,我们从分化体系中成功分离并扩增了CD45+CD43+CD11c+造血祖细胞,后者可在甲基纤维素培养基中分化形成CFU-G、CFU-M和CFU-GM等集落形成单位。为研究成熟免疫细胞功能,我们利用相关细胞因子进一步分化得到CD11c+CD14+CD163+巨噬细胞。我们通过体外实验证实WAS-iPSCs来源的巨噬细胞具有抗原摄取与处理能力、吞噬作用、趋化作用等巨噬细胞经典生物学行为。同时,我们通过免疫荧光染色观察到WAS-iPSCs来源的巨噬细胞由于WAS蛋白功能不全所导致的足体结构形成缺陷。综上,本研究所建立的WAS-iPSCs克隆为研究WAS蛋白在血液免疫系统发育过程中的作用提供了理想的体外模型,经过基因纠正后,将为WAS综合征患者的干细胞基因治疗提供无限细胞来源。 ‘第三章TALEN介导的WAS基因高效靶向编辑 对患者来源iPSCs的病变基因进行安全高效的修复是个体化干细胞基因治疗的关键。转录激活子样效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)介导的基因靶向编辑是目前哺乳动物基因组改造最有前景的策略之一。但是,TALEN的优化设计方案、以及TALEN表达质粒与基因编辑模板的细胞导入方案还没有很好地建立。因此TALEN介导的基因靶向编辑效率普遍较低。本研究针对WAS基因6号内含子高突变位点设计了一系列TALEN组合,并探讨了TALEN靶序列和spacer长度对靶向基因剪切效率的影响,从而优化了TALEN的设计方案。同时,我们采用整合酶缺陷型慢病毒载体(Integration-defective Lentiviral Vectors, IDLVs)作为基因编辑模板的导入手段,使TALEN介导的靶向基因编辑效率大幅提高。本研究为实现人iPSCs的高效基因改造提供了新的优化策略。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.5

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本文编号：2582021