Rheb1在出生后小鼠心脏生长及功能维持中的作用研究

发布时间：2020-03-08 20:22

【摘要】：背景：儿童心力衰竭是严重威胁小儿健康的世界性难题。在婴儿期间,心脏发育的特点是快速生长和生理性重构。出生后各种原因引起的心脏生长和重构异常导致心脏发育异常,最终发展成心力衰竭。蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt)信号通路调控出生后心脏生长,Akt通过激活下游哺乳动物雷帕霉素靶点蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex1, mTORC1)控制蛋白质合成、能量代谢、凋亡和自噬等重要生命过程。脑组织富含的Ras同源物1(ras homologue enriched in brain, Rheb1)是mTORC1上游分子,属于小GTP酶Ras超家族成员。以往主要研究了Rheb1在成年大鼠和小鼠心肌细胞中的作用。如Rheb1通过激活mTORC1信号通路调控成年大鼠心肌细胞生理性肥厚过程。我们课题组前期研究表明,Rheb1通过mTORC1信号通路调控成年小鼠心脏病理性重构。关于Rheb1在出生后(幼年)心脏生长中的作用尚不清楚。目的：探究Rheb1在小鼠出生后心脏生长及生理性重构中的作用。方法：通过心脏特异性基因敲除方法,在小鼠出生后心肌细胞中敲除Rheb1。通过大体形态、组织切片、特殊染色和电镜,观察Rheb1心肌特异性敲除小鼠心脏结构的变化,同时测量Rheb1敲除小鼠的重要生理参数体重、心重和心重体重比。通过离体心脏灌流的方法分离心肌细胞,观察Rheb1心肌特异性敲除小鼠心肌细胞形态学变化。通过心脏超声和心电图观察Rheb1敲除对小鼠心脏功能和电活动的影响。通过蛋白印迹(western blot)、实时定量荧光聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和免疫荧光方法检测mTORC1信号通路、Akt信号通路、自噬和凋亡标记物和代谢相关基因的变化,对Rheb1敲除相关表型的分子机制进行研究。最后通过进一步敲除磷酸酶张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, Pten)和Aktl改变Akt活性,观察改变Akt活性变化对Rheb1敲除小鼠存活的影响。结果：各种基因型小鼠出生比例符合孟德尔遗传学规律。Rheb1基因在出生后第三天部分敲除,第五至七天完全敲除。Western blot检测提示,Rheb1蛋白水平在出生后第七天较对照组显著下降。Rheb1敲除小鼠出生后第11天开始死亡,第16天全部死亡,中位生存时间12.5天。正常小鼠心脏重量和心肌细胞面积随时间而增加,Rheb1敲除小鼠心脏重量和心肌细胞面积第九天开始停止增加,心重体重比显著低于对照组。麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色示Rheb1敲除小鼠出生后第9天心肌细胞数目较对照组显著减少。Rheb1敲除组小鼠体重于死亡前1-2天下降并显著低于对照组。与正常对照组小鼠比较,Rhebl敲除小鼠第十天出现左室射血分数显著下降和恶性心律失常,左室舒张末内径第12天显著增大。电镜检测发现Rheb1敲除小鼠心肌线粒体较对照组显著受损。‘TUNEL和凋亡标记物检测发现Rheb1敲除小鼠心肌细胞凋亡较对照组显著增加。与对照组相比,Rheb1敲除组自噬标记物LC3Ⅰ水平显著降低,而LC3Ⅱ水平没有相应增加。Western blot和qPCR检测显示,与对照组相比,Rheb1敲除组mTORC1下游信号分子核糖体蛋白6(ribosomal protein6, S6)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor4E binding protein1,4E-BP1)磷酸化水平显著下降,代谢相关基因显著下调。进一步凋亡相关信号分子检测发现,Rheb1敲除小鼠内质网应激标记物capspasel2、C/EBP同源物蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、磷酸化c-Jun氮末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、激活作用转录因子6(activating transcription factor6, ATF6)和剪切的X盒结合蛋白-1(spliced X-box binding protein-1, sXBP)较对照组显著上调。与对照组相比,Rheb1敲除组Akt活性显著增加。通过Rheb/Pten双敲除提高Akt活性可以延长Rheb1敲除小鼠存活。结论： Rheb1是小鼠出生后心脏mTORC1信号激活所必需,Rheb1通过激活mTORC1信号调控出生后心肌细胞生长、能量代谢、存活、心脏功能及电生理稳态。在小鼠出生后心脏中,Rheb1-mTORC1信号和内质网应激相关信号存在对话,调控出生后心肌细胞凋亡。Rheb1可能通过mTORC1依赖与非mTORC1依赖的方式调控出生后心肌细胞自噬。提高Akt活性有助于改善幼年心衰小鼠存活。
【图文】：

示意图,诱导信号,蛋白酶体,信号通路

内质网应激诱导信号通路洞亡示意图

示意图,信号,雷帕霉素,同源物

图3-2 Rhebl-mTORCl信号与内质网应激关系示意图l 代表脑组织富含的 Ras 同源物 1 (Ras homologue enriched in brain 1), mTORCl 代表动物雷帕霉素作用IE点蛋白复合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1), ER内质网（endoplasmic reticulum)。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.4

【共引文献】