NOTCH1复合杂合与法洛四联症关系的探索研究

发布时间：2020-03-23 03:26

【摘要】：先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是胚胎发育时期由于心管扭曲成袢异常,或出生后应自动关闭的通道未能闭合而引起的心脏解剖结构异常,是新生儿最常见的出生缺陷,也是全球范围内婴幼儿死亡的主要原因之一。流行病学资料显示,先天性心脏病的出生患病率约为0.6%~1.2%。先天性心脏病的主要类型有室间隔缺损(Ventricular septal defects,VSDs)、房间隔缺损(Atrial septal defects,ASDs)、房室间隔缺损(atrioventricular septal defect,AVSD)、动脉导管未闭(Patent ductus arteriosus,PDA)、法洛四联症(Tetralogy of Fallot,TOF)、右心室双向流出道(Right ventricular outflow tract,RVOT)等。法洛四联症是最严重的紫绀型先天性心脏病之一,是由于胚胎时期圆锥动脉干发育异常所致,在新生儿中出生患病率约为1/3000,占到所有先天性心脏病的5%。随着先进医疗技术的发展,TOF的早期致死率并不高,但患者会伴有长期的后遗症,如心率不齐、心室功能性障碍甚至导致终生的残疾。先天性心脏病的病因复杂,一般认为与遗传因素和环境因素相关。环境因素主要是母亲孕期暴露,包括有害环境暴露,药物暴露,营养因素等。大量的遗传学研究已证实先天性心脏病的发生与遗传因素有关,主要包括染色体异常、单基因遗传缺陷、多基因缺陷、拷贝数变异等。法洛四联症作为最常见的紫绀型先天性心脏病,遗传致病原因多种多样,染色体异常包括染色体22q11.2缺失(DiGeorge综合症)和21三体(Down综合症)等,分别占法洛四联症发病率的15%和7%。TBX1,NKX2-5,GATA4,ZFPM2,GATA6,GDF1,JAG1等单个基因的变异都会引起法洛四联症。然而大部分法洛四联症患者的遗传病因并不明确。以往研究多针对基因的编码区域,而目前大量研究报道了远端调控元件中非编码突变导致疾病发生,例如,Smemo S等~([1])通过基因组学,生物信息学和小鼠基因工程结合,证明TBX5增强子中的非编码突变可能引起与TBX5功能障碍相关的CHD。Sankaran VG等对在β-珠蛋白基因座上有异常缺失的3个家系进行研究,鉴定出一个胎儿血红蛋白(基因)沉默所必需的靠近δ-珠蛋白基因的基因间区域。但是非编码变异在人类复杂疾病(包括先天性心脏病)中的潜在作用仍然知之甚少。随着Roadmap表观基因组学项目(Epigenomics Roadmap Project)和DNA元件百科全书计划(Encyclopedia of DNA Elements,ENCODE)等大型非编码区研究项目的开展,非编码区域突变受到越来越多的关注。自人类基因组计划完成以来,二代测序技术飞速发展,通过借助全基因组测序技术和生物信息学工具,可以最大程度地利用现有数据研究法洛四联症新的致病基因和致病位点,从而更深层次地揭示法洛四联症的分子机制。本课题对两个单纯型法洛四联症核心家系(两个非患病父母和一个患病孩子)成员进行了全基因组测序(whole genome sequencing,WGS),测序数据使用针对编码区突变,调控元件中非编码区突变以及复合杂合突变的致病变异筛选流程,尝试探索单纯型法洛四联症患者的遗传学病因。通过多个数据库和软件分析注释编码突变(包括新生和遗传性突变),以及调控元件中的非编码突变。发现在编码区不存在满足美国医学遗传学与基因组学学会(American Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南标准的致病性突变(第一类突变)。我们将其余预测为潜在有害的编码突变归为一类用于后续研究(第二类突变),并且基于积分法预测调控元件(IM-PET)方法得到的调控元件数据库,在非编码区鉴定了位于调控元件中的潜在有害突变,随后把相同基因上的复合杂合突变归为一类(第三类突变)。使用ToppGene软件对复合杂合突变所在目标基因进行优先排序,最终在先证者中鉴定了位于优先基因上的可能致病编码突变和非编码突变组合的复合杂合模式。在先证者P1中,检测到NOTCH1外显子及其调控元件中的双等位基因突变(chr9:g.139409115AT,p.Asn685Ile;chr9:g.13944949 CA)分别遗传自先证者的父母。在先证者P2中发现与P1类似的遗传模式,鉴定了可能调控FN1基因功能的复合杂合突变(chr2:216235029CT,p.Val2281Met;chr2:g.2166525154AC),分别位于FN1基因的编码区和非编码区。NOTCH1是已发现的经典先天性心脏病病致病基因。我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,荧光素酶报告基因等体外功能实验,进一步验证NOTCH1潜在调控元件及其调控区域内相应非编码突变的功能效应。CRISPR/Cas9基因编辑实验结果表明,在NOTCH1非编码区域杂合敲除(Region~(+/-))和纯合敲除(Region~(-/-))的HEK293T细胞克隆中,NOTCH1基因的表达显著高于野生型克隆(Region~(+/+)),表明这个潜在调控区域发挥沉默子的功能。并且纯合敲除克隆(Region~(-/-))中的NOTCH1表达最高,说明存在一定的剂量敏感效应。荧光素酶报告基因检测结果显示,携带非编码突变序列的质粒荧光素酶活性水平显著低于野生型,表明调控元件上的非编码突变增加了沉默子的活性,导致NOTCH1的表达进一步降低。结合CRISPR/Cas9敲除结果得出结论,沉默子区域的非编码突变降低了NOTCH1的表达。综上所述,本研究通过对两个单纯型TOF家系进行全基因组测序,对编码区和非编码功能区变异进行注释和筛选,尝试探索了调控元件中非编码突变和编码突变的复合杂合遗传模式与TOF发病的关系,并且通过体外实验证实了该非编码区域和相应突变的功能效应。结果表明,这种复合杂合突变可以增加TOF的外显率,本研究结果为TOF遗传结构研究提供了新的线索。
【图文】：

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南京医科大学硕士学位论文值对候选基因进行排序，，最终确定先证者最优先致病基因和致病突变。先前已报道了 6 个明确的 TOF（OMIM＃187500）致病基因: GATA6，GDF1，JAG1，NKX2-5，TBX1，ZFPM2[42]，我们将这 6 个基因列为训练集基因，使用ToppGene 基于训练集基因的功能相似性对先证者的目标候选基因进行识别和优先排序。本研究使用的 ToppGene 训练参数设置为：GO: molecular function, GO:biological process, GO: cellular component, human phenotype, mouse phenotype,pathway, PubMed, disease 的 FDR 校正 P 值临界值 0.05，gene limits 1-2,000，检测参数设置为默认值。筛选致病变异分析流程如图 1 所示。

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17图 2. CRISPR/Cas9 区域敲除该图显示 CRISPR/Cas9 敲除系统的基因组编辑结果。A：敲除区域和非编码突变位置，以及CRISPR/Cas9 敲除系统的示意图。B：凝胶电泳检测不同克隆中基因编辑结果。C：Sanger测序验证基因组序列，包括纯合克隆的反义序列。2.2.10 细胞 RNA 提取和质检通过 TRIzol LS 试剂从 HEK293T 细胞中提取总 RNA。具体实验步骤如下：（1）收集 HEK293T 细胞，胰酶消化，3000×g 离心 5min，PBS 洗涤两次。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.4

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