TRIM2调控EV71感染重症手足口病固有免疫反应的机制研究

发布时间：2020-03-26 03:35

【摘要】：2008年以来我国手足口病年发病数及死亡病例数都占丙类传染病的第一位,是亟待解决的重大公共卫生问题。手足口病重症感染患者则会出现严重的中枢神经系统症状以及并发症,严重危害婴幼儿的健康。重症手足口病的影响因素分析,对于手足口病特别是重症手足口病的防治具有重要意义。越来越多的研究表明TRIM(Tripartite motif)蛋白家族在病毒诱导的固有免疫反应中发挥重要的调控作用。本课题以探索TRIM2在EV71触发的固有免疫反应中的作用及机制展开研究,从而为EV71感染手足口病的防治提供思路。第一部分深圳市重症手足口病相关危险因素分析目的探讨深圳市手足口病重症病例的影响因素,为减少重症手足口病的发生,降低手足口病的伤害提供科学参考。方法收集2012-2016年深圳市卫计委指定的重症手足口病收治医院的727例重症手足口病患者资料以及同期深圳市另外2家综合医院儿科或感染科的680例轻症手足口病病例资料,采用单因素χ2检验及多因素Logistic回归分析对手足口病重症病例发病危险因素进行分析。结果单因素χ2检验结果显示性别、年龄、患儿职业分类、户口类型、是否参加医疗保险、喂养方式、发病前一个月是否接种疫苗、发热、出疹、EV71、CA16等11个因素有统计学意义;多因素Logistic回归分析结果显示:散居儿童、发热以及感染EV71是手足口病重症病例的影响因素,OR值(95%CI)分别为3.86(1.156～12.987)、6.836 2.315～20.184)和8.746(3.729～20.511)。第二部分TRIM2在EV71感染手足口病固有免疫反应中的作用和机制研究目的研究显示TRIM家族成员在病毒诱导的固有免疫中发挥作用,而TRIM2调控抗病毒固有免疫的机制目前并不清楚。本次课题旨在研究TRIM2在EV71诱导的固有免疫中发挥的作用及作用机制,以期为EV71感染致手足口病的临床治疗以及药物和新型疫苗的研发提供理论基础。方法1采用基因芯片检测EV71感染THP1诱导分化成的巨噬细胞(t-M(?))后,TRIM家族分子表达变化情况,筛选表达差异变化有显著性的TRIM分子。2采用实时荧光定量PCR验证t-M(?)中筛选到的TRIM家族分子mRNA表达水平。3在t-M(?)中过表达TRIM2或以siRNA靶向干扰TRIM2后,给以EV71感染,采用实时荧光定量PCR检测细胞因子mRNA表达变化情况。4在t-M(?)中过表达TRIM2或以siRNA靶向干扰TRIM2后,给以EV71感染,采用Western blot实验检测固有免疫信号通路中不同信号分子活化情况以及EV71结构蛋白VP1的表达水平情况。5利用蛋白质免疫共沉淀及Western blot实验检测TRIM2与MDA5的相互作用情况,以及TRIM2对MDA5泛素化的影响。结果1 EV71感染t-M(?)后,TRIM家族分子发生了不同程度表达变化,其中TRIM2表达下降最为显著。2过表达TRIM2显著抑制EV71感染诱导的细胞因子IL-6,TNF-α和CCL3的产生。干扰TRIM2表达促进EV71感染诱导的细胞因子IL-6,TNF-α和CCL3的产生。3过表达TRIM2抑制MAPK和NF-κB通路中信号分子的活化,促进EV71复制。干扰TRIM2表达后能促进MAPK和NF-κB通路中信号分子活化,抑制EV71复制。4 TRIM2通过与模式识别受体MDA5相互作用,促进MDA5的K48位泛素化降解,从而负向调控MDA5下游MAPK和NF-κB信号通路活化。结论1重症手足口病影响因素众多,散居儿童、发热、有EV71感染是重症手足口病的危险因素。2 EV71感染后,TRIM2与模式识别受体MDA5相互作用,促进MDA5的K48位泛素化,阻碍MAPK和NF-κB通路中各接头分子的活化,抑制EV71诱导的细胞因子的产生,实现对EV71感染手足口病固有免疫反应的负向调控。
【图文】：

巨噬细胞,诱导分化,家族,免疫反应

得到了与芯片一致的结果（图3.1C）。结果显示在 EV71 感染巨噬细胞中，TRIM25、TRIM14、TRIM69 和 TRIM21在 EV71 感染时表达上调，，其中 TRIM25 表达上调最为显著。另外，在 EV71 感染后，TRIM2、TRIM44 和 TRIM32 发生了表达水平的降低，TRIM2 的表达下调最为明显。提示这些 TRIM 分子在 EV71 感染固有免疫反应过程中可能会发挥作用。在 EV71 感染巨噬细胞后，我们筛选到表达上调和下调最为显著的两个TRIM 分子中，TRIM25 在抗病毒固有免疫反应中的调控作用已经得证实。而TRIM2 在 EV71 感染免疫调控中的作用目前尚无报道

过表达,细胞因子,单克隆,质粒

这三个质粒进行酶切检验后电泳，1-5 道为 HA-TRIM2 不同的单克隆质粒，6-10道为myc-TRIM2不同的单克隆质粒，11-15道为flag-TRIM2不同的单克隆质粒；M 道为 Marker。（D）以 HA-TRIM2，Myc-TRIM2，Flag-TRIM2 以及对应标签的空载体作为对照转染 HEK293T 细胞，48 小时后，提取细胞蛋白，利用对应的标签抗体检测 TRIM2 的表达。3.3 过表达 TRIM2 对 EV71 诱导的细胞因子产生有抑制作用为了研究 TRIM2 在 EV71 感染引起的固有免疫反应中的功能，我们利用上述构建成功的 TRIM2 质粒转染 t-M ，并观察过表达 TRIM2 对细胞因子产生的影响。结果显示，在 t-M 中转染 HA-TRIM2 可以显著提高 TRIM2 的 mRNA 和蛋白表达水平（3.3A、3.3B）。当以 EV71 感染转染后的细胞时，TRIM2 过表达组与对照组相比，能够显著抑制细胞因子 IL-6、TNF-α 及 CCL3 的表达（图 3.3C），说明 TRIM2 对 EV71 诱导的细胞因子产生具有抑制作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.1

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