不同剂量托吡酯对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑保护作用的实验研究

发布时间：2020-03-30 07:41

【摘要】： 研究背景缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是新生儿期常见的疾病,是导致新生儿死亡和远期神经系统发育障碍的重要因素。由于其发病机制尚不明确,对其损伤后的治疗仍无有力措施。探讨发病机制并在其关键分子上进行有效干预,对于改善HIE预后,提高人口质量具有重要意义。托吡酯(topiramate,TPM),是一种高效新型抗癫痫药,大量实验表明其在脑损伤后脑保护中发挥着重要作用。越来越多的研究表明托吡酯在保护缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)发挥着重要的作用,未来有可能用于临床治疗HIBD。但是关于托吡酯脑保护作用的具体机制、给药剂量及药物副作用等目前研究较少。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是TGF-β超家族的一个新亚族成员,发挥着多效能的神经营养作用,并且在改善和促进损伤后的神经元修复和再生中发挥着重要作用。脑缺氧缺血可能是脑内GDNF分泌增加的启动因素之一,本课题组前期通过对7日龄的Wistar大鼠研究发现,HIBD假手术组偶见GDNF表达;单纯缺氧缺血组GDNF于缺氧缺血后12h开始上升,第2d进一步升高,第3d达高峰,第5d有所回落。有研究表明,星形胶质细胞除了表达Na~+和Ca~(2+)通道以外,GluR及GABAR在其细胞膜表明亦有表达,鉴于托吡酯具有抑制Na~+或/和Ca~(2+)通道激活以及调节脑内GluR及GABA平衡之功效。因此,我们推测托吡酯有可能通过作用于星形胶质细胞表达的相应受体,达到保护星形胶质细胞,促进GDNF的分泌,进而起到保护神经元的作用。本课题组的前期研究已证实这一点,我们的研究显示:不同时间托吡酯给药后观察组GDNF的分泌量具有差异性。本课题组前期研究已证明托吡酯用于HIBD的治疗时间窗较短,为缺氧缺血后2h之内,且预防用药优于损伤后用药;托吡酯的脑保护作用与GDNF的分泌增加有直接关系。许多动物实验研究显示托吡酯对脑缺血有明显的治疗作用,剂量多在50mg/kg-200mg/kg之间,并未产生损伤边缘系统及影响骨骼发育等副作用。本课题通过建立HIBD动物模型,借助观察脑损伤后给予不同剂量托吡酯对脑组织病理学改变、GDNF动态表达水平等方面的影响,进一步探讨托吡酯脑保护作用的机制、用药剂量,为托吡酯临床治疗HIE提供强有力的理论和试验依据,为HIE的治疗开辟一条新的道路。目的 1.观察新生大鼠各处理组相同时间点脑组织的病理学改变。 2.观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后GDNF表达水平的动态变化及不同剂量托吡酯干预对GDNF表达的影响。 3.探讨托吡酯脑保护作用的机制。方法 1.120只新生7日龄Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯缺氧缺血组及托吡酯治疗组,托吡酯治疗组根据不同给药剂量分为50mg/kg、100mg/kg及150mg/kg治疗组。 2.建立HIBD动物模型。 3.给药及处理方法 (1)托吡酯治疗组:将托吡酯溶于注射用水配成2%溶液,采用小型灌胃器灌胃。不同剂量托吡酯治疗组分别于手术前30min给予1次、HIBD模型建成后即刻给予1次、之后每隔12h各一次,直至第5d。 (2)单纯缺氧缺血组和假手术组同一时间点给予等体积的生理盐水。 (3)各组均在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分别处死1/4的动物。 4.应用HE染色、免疫组织化学(Immunocytochemistry)及Western Blotting等试验方法,观察和测定研究指标。结果 1.HE染色结果假手术组脑组织结构层次清晰,细胞轮廓清楚,核居中,尼氏体位于核周边;单纯缺氧缺血组在缺氧缺血后12h缺血侧皮质、纹状体出现轻微的病理变化,第2d病变最严重,表现为皮质、纹状体、海马、丘脑大片坏死区,第3d病变减轻,出现胶质细胞增生,第5d基本上未见破裂细胞,出现大片胶质瘢痕;50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治疗组术后12h上述部位病变不明显,第2d出现轻微病变,表现为极少数细胞间隙增宽,细胞核浓缩,第3d、5d未见明显病灶;其中150mg/kg托吡酯治疗组脑损伤减轻程度较100mg/kg托吡酯治疗组明显,而100mg/kg托吡酯治疗组又优于50mg/kg托吡酯治疗组,50mg/kg托吡酯治疗组较单纯缺氧缺血组脑损伤程度减轻。 2.免疫组织化学假手术组仅见较少的GDNF阳性细胞表达,着色较浅,稀疏地分布于整个大脑皮质、纹状体、海马,双侧对称,各时间点上检测未见明显的动态变化;单纯缺氧缺血组和托吡酯各治疗组非缺血侧GDNF阳性细胞染色的程度、数量及变化情况均类似于假手术组;单纯缺氧缺血组缺血侧皮质GDNF阳性细胞在损伤后12h开始表达,第2d进一步上升,第3d达高峰,第5d基本恢复正常,仅见极少量的GDNF表达;50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治疗组缺血侧皮质在损伤后12h即可见较多GDNF表达,第2d进一步增加,第3d达高峰,第5d有所减少,但还可见较多的表达,且150mg/kg托吡酯治疗组GDNF的表达尤为明显,托吡酯治疗组在每个时间点上GDNF的表达均明显高于单纯缺氧缺血组(P＜0.05)。GDNF的表达增加与托吡酯成剂量正相关,有统计学意义(各时相点相比均P＜0.05)。 3.Western blotting单纯缺氧缺血组与托吡酯各处理组均有GDNF蛋白表达条带,150mg/kg托吡酯治疗组蛋白表达明显高于单纯缺氧缺血组,100mg/kg托吡酯治疗组稍弱,50mg/kg托吡酯治疗组较差。应用生物凝胶电泳图像分析系统(Alphaimager2200)扫描定量,通过计算出各组蛋白表达的相对积分值作出蛋白的相对含量,经过统计学处理发现:50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治疗组各时间点上蛋白表达均高于单纯缺氧缺血组,有统计学意义(P＜0.05);GDNF的表达增加与托吡酯成剂量正相关,有统计学意义(各时相点相比P均＜0.05)。结论 1.托吡酯可以明显减轻缺氧缺血导致的脑细胞水肿、液化、坏死,发挥较好的脑保护作用,托吡酯对神经元的保护作用呈剂量正相关。 2.托吡酯可使缺氧缺血性脑损伤后GDNF表达升高,其表达升高程度与托吡酯呈剂量正相关。 3.增加胶质细胞分泌GDNF可能是托吡酯脑保护作用机制之一。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R722.1

【参考文献】