【摘要】： 目的氧疗是一种临床常用治疗手段,挽救了大量新生儿的生命,但可带来由于持续用氧治疗后的一种肺氧化应激性损伤疾病-支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)为肺泡上皮的干细胞,肺泡上皮的修复完全依赖AT-Ⅱ的增殖、分化为肺泡Ι型上皮细胞(alveolar typeⅠepithelial cell, AT-Ι)。BPD的发生发展与AT-Ⅱ增殖、存活和凋亡密切相关。而p38蛋白激酶(p38 MAP kinase, p38MAPK)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路三个主要的亚家族之一,与细胞增殖、存活和凋亡密切相关。本文以体外培养的大鼠原代AT-Ⅱ为研究对象,以不同浓度过氧化氢(H_2O_2)处理AT-Ⅱ,探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)诱导AT-Ⅱ细胞存活、凋亡及p38MAPK对氧化应激状态下AT-Ⅱ修复存活,凋亡的调控作用。 方法以免疫粘附法分离纯化清洁级Spraque-Dawley成年大鼠AT-Ⅱ,台盼兰拒染法鉴定细胞活性,改良巴氏染色法鉴定细胞纯度,电镜直接观察AT-Ⅱ细胞形态为细胞培养物定性。采用过氧化氢(H_2O_2)处理模拟机体ROS攻击AT-Ⅱ的体内情况,建立氧化性细胞损伤模型。实验分为对照组(加无血清培养基)、H_2O_2处理组(无血清培养基中含10、100、500和1000μM H_2O_2)和p38MAPK干预组(加p38MAPK抑制剂SB203580)。采用倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化,以四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)检测细胞存活率,Annexin-Ⅴ和PI双染色后流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测H_2O_2处理后AT-Ⅱ细胞磷酸化p38MAPK (Phospho-p38MAPK, p-p38MAPK)的表达,并观察p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预后细胞存活率和凋亡率的变化及p-p38MAPK表达的变化。 结果以胰蛋白酶分离,免疫粘附法纯化建立AT-Ⅱ原代培养的方法可收获细胞1-2×10~7个/鼠,纯度和活性90%。电镜观察培养40小时的细胞,可见AT-Ⅱ细胞特征性结构——嗜锇性板层小体。H_2O_2处理AT-Ⅱ180min,与对照组比较,10μM H_2O_2处理组的细胞形态无明显差异;100μM H_2O_2处理组细胞间隙稍增宽;500μM H_2O_2处理组细胞间隙增宽,贴壁细胞数量减少,细胞皱缩,胞内可见空泡;1000μM H_2O_2处理组贴壁细胞数量大大减少,细胞皱缩明显,可见脱壁细胞和细胞碎片,同时透射电镜下观察到凋亡细胞的凋亡小体。MTT法和流式细胞术检测结果显示,10μM和100μM H_2O_2攻击AT-Ⅱ180min,细胞存活率和凋亡率与对照组比较无明显变化(P0.05),而500μM和1000μM H_2O_2攻击AT-Ⅱ可使细胞存活率由对照组的97.50±2.588%降至80.67±6.121%和44.50±2.429%(P0.05),凋亡率由7.8960±4.4065%增至29.2420±4.2045%和48.8800±8.6261%(P 0.05)。使用p38MAPK抑制剂SB203580干预后500μMH_2O_2处理AT-Ⅱ180min,与单纯500μMH_2O_2处理组比较,AT-Ⅱ贴壁细胞数量进一步减少,细胞间隙增宽,细胞皱缩明显,可见脱壁细胞和细胞碎片,AT-Ⅱ存活率更加降低(P0.05)和凋亡率进一步增高(P0.05)。另外,H_2O_2可刺激p-p38MAPK阳性表达,以刺激15min表达最强。p38MAPK抑制剂SB203580能有效阻断H_2O_2刺激下p-p38MAPK的阳性表达。 结论 1.以胰蛋白酶分离、免疫粘附法纯化建立AT-Ⅱ细胞原代培养的方法,能够获得满意的细胞产量、纯度和活性,满足氧化性细胞损伤模型的制备。 2. ROS可以诱导AT-Ⅱ细胞存活率下降和调亡率增加,并呈剂量依赖性。 3. p38MAPK信号通路参与了氧化应激状态下AT-Ⅱ细胞存活和凋亡的信号转导途径,对氧化应激状态下的AT-Ⅱ细胞可能起到保护作用。
【图文】：
图 8 不同浓度 H2O2对 AT-Ⅱ细胞存活率的影响Fig 8 Dose-effect curve of cell’s survival ratios in H2O2-treated AT-Ⅱcells注：与对照组相较，P＜ 0.05,#与 500μM H2O2处理组比较，P＜ 0.05不同浓度 H2O2处理(ROS 攻击)AT-Ⅱ180min 细胞凋亡式细胞术定量)照组比较，10μM 和 100μM H2O2刺激后细胞凋亡率无明显变化(P＞O2浓度递增，500 μM 和 1000μM H2O2处理 AT-Ⅱ后，AT-Ⅱ细胞凋亡性差异(P＜0.05)，呈剂量依赖性(表 2，，图 9，10)。表 2 不同浓度 H2O2处理后 AT-Ⅱ细胞凋亡率的变化( x ±s , n=5)Table 2 Apoptotic ratios of AT-Ⅱ cells treated by different concentration of H2O
30仪检测结果显示不同浓度 H2O2处理后 AT-Ⅱ细胞ect of apoptosis in H2O2-treated AT-Ⅱcells measure照组、10μM、100μM、500μM 和 1000μM H2O2处
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R720.597
【共引文献】
相关期刊论文 前10条
1 蔡宛如;洪辉华;骆仙芳;张弘;王新华;;芪冬活血饮对油酸致大鼠内皮素-1水平的影响[J];浙江中医药大学学报;2008年02期
2 罗真春;凌宗秀;;核转录因子kappa B与急性肺损伤[J];重庆医学;2006年03期
3 谢蓉,董文;核因子-κB的活化及其在急性肺损伤中的作用机制[J];福建医药杂志;2004年01期
4 乔凯;李宏云;杨闪闪;贾宝辉;;地塞米松对ALI/ARDS大鼠的保护作用及对糖皮质激素受体表达的影响[J];医药论坛杂志;2012年04期
5 刘庆文;林春榕;吴学东;;核转录因子NF-κB与肾脏缺血-再灌注损伤[J];中外医疗;2011年09期
6 熊燕,贾汝汉;肾素-血管紧张素系统在糖尿病肾病发病机制中的新认识[J];中国中西医结合肾病杂志;2004年09期
7 吴仕平;陈明;;替米沙坦联合阿托伐他汀对糖尿病大鼠内皮细胞形态、功能的影响[J];中国动脉硬化杂志;2010年07期
8 陈玉君;刘唐威;陈克正;庞玉生;;前内皮素原mRNA在新生鼠肺出血发生过程中肺内的表达及作用[J];临床儿科杂志;2007年10期
9 杨勇;傅晓青;董礼文;王军;程根苗;;益气补肺方对急性肺损伤大鼠ET-1和MIF水平的影响[J];浙江临床医学;2008年04期
10 丁登峰,任永功,张雪萍;核因子-κB在急性呼吸窘迫综合征发病中的作用[J];内科急危重症杂志;2004年04期
相关博士学位论文 前10条
1 王雪慧;通腑汤对急性肺损伤大鼠相关炎性因子及核转录因子κB的影响[D];黑龙江中医药大学;2011年
2 胡泽平;替米沙坦对高血压和动脉粥样硬化血管内皮功能的影响及其机制[D];安徽医科大学;2011年
3 王雁;肝细胞生长因子和血管紧张素转化酶与妊高征血管内皮细胞损伤的研究[D];中国医科大学;2004年
4 刘松;大剂量火箭液体推进剂吸入引起的急性肺损伤—发生机制及药物防治研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
5 周U
本文编号：2611254
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/eklw/2611254.html
