内毒素血症幼年大鼠胃黏膜细胞保护作用及PAF受体拮抗剂干预的研究

发布时间：2020-04-04 22:38

【摘要】： 急性胃黏膜损伤是严重感染、外伤、休克等危重症的常见并发症,在上述疾病中发病率可高达60-100%;未经治疗者大出血率达15%,常常危及生命。其发生原因是由于胃黏膜保护机制削弱,损伤因素相对增强所致。近年研究发现肽类物质在胃粘膜损伤的保护和修复方面发挥重要作用。胃黏膜上皮的生长、更新和修复的过程是受到严格调控的,这一调控机制主要来自黏膜本身,有多种肽类物质参与,其修复能力可能与这些肽类物质的表达水平有关。在儿科危重症中,重症感染是急性胃黏膜损伤的常见原因。在重症感染内毒素血症时肽类物质如何发挥对胃粘膜损伤的保护和修复作用目前尚不清楚,是否是通过传统的前列腺素途径发挥作用,尚缺少研究报道。乳癌相关肽(pS2)即三叶因子1(TFF1)为三叶肽家族一成员,其结构是6个半胱氨酸残基形成3个链内二硫桥。pS2通过调节细胞增殖而使胃黏膜具有防御和修复功能,其对不同细胞系具有促有丝分裂作用。pS2在内毒素血症幼年大鼠胃粘膜中的表达变化及对胃粘膜的保护和修复作用机制尚不清楚。转化生长因子-alpha(TGF-α)是表皮生长因子家族中一类胃黏膜损伤后修复的主要调节肽,能促进胃黏膜上皮的代谢和生长。由于胃黏膜本身合成TGF-α,所以TGF-α是维持胃黏膜完整性最重要的肽类物质。在内毒素血症幼年大鼠胃粘膜中TGF-α表达变化及pS2基因、TGF-α基因、表达的时相关系尚需研究。环氧合酶-2(COX-2)为COX同工酶的诱导型,是前列腺素(PGs)合成过程中一个重要的限速酶。前列腺素是一种脂质,主要在精囊、肾髓质、肺和胃肠道中合成。PG的不断产生和释放对胃黏膜细胞起保护作用,促进胃黏膜细胞愈合。在内毒素血症幼年大鼠胃粘膜中COX-2表达变化及调控、前列腺素E_2(Prostaglandin E_2,PGE_2)浓度变化尚不十分清楚。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是NOS同工酶的诱导型,内源性一氧化氮(NO)的产量有赖于细胞iNOS的表达量。在内毒素血症幼年大鼠胃粘膜中iNOS表达变化及调控、NO含量变化及对胃粘膜的作用尚不十分清楚。增殖细胞核抗原(PCNA)是一种分子量为35712u(36000道尔顿)核蛋白,是细胞DNA合成不可缺少的因子,存在于细胞核内不同部位,PC-NA的出现与细胞增殖周期密切相关,是反映细胞增殖活性的重要生物学指标。PCNA在内毒素血症幼年大鼠胃粘膜中的变化尚未见报道。血小板活化因子(PAF)是迄今发现的内源性溃疡形成介子中最强的一个,对其它炎性细胞因子的作用起增强作用。PAF受体拮抗剂能显著改变内毒素或PAF引起的血流动力学变化及组织器官的损伤。本研究的目的是通过观察幼年大鼠内毒素血症时胃黏膜上皮细胞、壁细胞超微结构和PGE_2、NO的变化,胃黏膜COX-2、iNOS、pS2、TGF-α蛋白及mRNA和PCNA蛋白表达变化,以及PAF受体拮抗剂对其影响,从细胞超微结构水平、蛋白质水平及分子水平探讨内毒素血症幼年大鼠胃黏膜细胞保护作用及PAF受体拮抗剂对其影响,研究胃粘膜损伤保护和修复调控的分子机制,为胃粘膜损伤的预防和治疗开辟新的途径,也为三叶肽制剂的临床应用提供理论依据。材料和方法 1.材料用腹腔注射内毒素(5 mg/kg O_(55):B_5脂多糖)方法制备18日龄Wistar大鼠内毒素血症动物模型,腹腔注射同等量生理盐水为对照组,腹腔注射内毒素前0.5 h腹腔注射PAF受体拮抗剂(5 mg/kg BN52021 GinkgolideB)为预防组,腹腔注射内毒素后0.5 h腹腔注射PAF受体拮抗剂(5 mg/kgBN52021 GinkgolideB)为治疗组。分别于内毒素腹腔注射后1.5,3,6,24,48,72 h断头处死动物,大体观察胃黏膜损伤情况,记录溃疡指数(UI);在腺胃区胃大弯处取0.5cm×0.5cm胃组织置入4%甲醛溶液中固定保存、取0.1cm×0.5cm胃黏膜切成1mm~3小块若干,投入2.5%戊二醛液中固定保存;留胃黏膜约0.5cm×0.5cm称重;其余部分用生理盐水冲洗3次,放入去RNA酶的试管中,液氮速冻,深低温冰箱-70℃保存。每组每时间点8只。 2.方法按Guth标准积分判定胃黏膜溃疡指数(UI),H-E染色光学显微镜检查胃黏膜病理改变,透射电镜观察胃黏膜上皮细胞、壁细胞超微结构改变,采用放射免疫法测定胃黏膜PGE_2浓度,硝酸还原酶的化学比色法测定胃黏膜NO含量;免疫组织化学SP方法测定pS2、TGF-α、COX-2、iNOS及PC-NA蛋白的表达,半定量RT-PCR法测定pS2、TGF-α、COX-2及iNOSmRNA的表达。用SPSS 10.0软件系统对实验结果进行统计学分析,组间比较采用方差分析。结果一、内毒素血症幼年大鼠胃黏膜上皮细胞、壁细胞超微结构变化及PAF受体拮抗剂对其影响大体观察LPS组腹腔注射内毒素后6 h胃黏膜损伤最重,表面可见大片糜烂、出血、条索状坏死,与胃纵轴平行,损伤主要见于腺胃区;光镜下黏膜表面上皮广泛脱落,黏膜内有出血,炎性细胞浸润,核碎裂、固缩,凋亡小体出现,腺体受损。此时胃黏膜UI记分最高,与对照组比较或各时间点比较,差异均非常显著(P0.01);PAF受体拮抗剂预防组和治疗组胃黏膜损伤程度明显减轻,UI记分显著降低。透射电镜观察可见LPS组6 h表面上皮细胞细胞间隙增宽,腔膜面破坏,细胞间紧密连接不连续,短小的微绒毛减少,线粒体严重肿胀,脊断裂甚至消失,呈空泡变性,粗面内质网扩张,核糖体脱落,染色质浓缩分部在核的周边,可见核固缩,核膜间隙增宽;壁细胞肿胀,可见盐酸小管扩张,部分有破坏呈空泡样改变,线粒体增多,部分空泡样改变,胞质内核糖体脱落,滑面内质网扩张。二、内毒素血症幼年大鼠胃黏膜COX-2、iNOS、PGE_2、NO变化及PAF受体拮抗剂对其影响 LPS组腹腔注射内毒素后6 h胃黏膜PGE_2浓度最低,此时LPS组较对照组PGE_2浓度明显降低(P0.01),PAF受体拮抗剂预防组、PAF受体拮抗剂治疗组较LPS组明显增高(P0.01),PAF受体拮抗剂预防组、PAF受体拮抗剂治疗组较对照组明显增高(P0.05)。LPS组腹腔注射内毒素后6 h胃黏膜NO含量最高,此时LPS组较对照组NO含量明显增高(P0.01),PAF受体拮抗剂预防组、PAF受体拮抗剂治疗组较LPS组明显降低(P0.01);PAF受体拮抗剂预防组、PAF受体拮抗剂治疗组较对照组明显增高(P0.05)。对照组胃黏膜组织未见COX-2、iNOS蛋白及mRNA的表达。LPS组腹腔注射内毒素后6 h COX-2蛋白在胃黏膜组织胞浆表达,48 h明显增高,其mRNA水平亦上调;PAF受体拮抗剂预防组和治疗组6 h COX-2蛋白表达明显增高、mRNA水平明显上调。LPS组腹腔注射内毒素后1.5h胃黏膜组织胞浆iNOS蛋白表达,6 h明显增高,24 h最高,48 h下降,72 h仍未恢复正常;其mRNA水平的表达变化与iNOS蛋白表达趋势相同。PAF受体拮抗剂预防组和治疗组3 h iNOS蛋白表达,6 h明显增高,48 h下降,72h同正常对照组;其mRNA水平的表达变化与iNOS蛋白表达趋势相同。三、内毒素血症幼年大鼠胃黏膜pS2、TGF-α和PCNA表达变化及PAF受体拮抗剂对其影响对照组胃黏膜组织胞核PCNA阳性染色很多,LPS组腹腔注射内毒素后3 h PCNA的表达就明显减低,6 h最低,24 h有所恢复,72 h未完全恢复正常。PAF受体拮抗剂预防组和治疗组胃黏膜组织胞核PCNA阳性染色无明显减少。对照组胃黏膜组织有pS2 mRNA、TGF-αmRNA表达。LPS组内毒素腹腔注射后1.5 h胃黏膜中pS2基因表达减弱,3 h恢复,6 h明显高于对照组,24 h最高,48 h-72 h有所下降,但仍明显高于对照组。PAF受体拮抗剂预防组和治疗组3h pS2 mRNA的表达就明显增强。LPS组腹腔注射内毒素后6h胃黏膜中TGF-αmRNA的表达明显增强,6 h-48h最强,72 h有所下降,仍高于正常对照组。PAF受体拮抗剂预防组和治疗组TGF-αmRNA的表达48 h恢复正常。免疫组化证实了胃黏膜pS2、TGF-α表达变化。结论 1.腹腔注射内毒素可致幼年大鼠急性胃黏膜损伤,胃黏膜上皮细胞、壁细胞超微结构发生变化;PAF受体拮抗剂可明显减轻内毒素血症时幼年大鼠急性胃黏膜损伤,由此得出PAF可能是引起幼年大鼠内毒素血症时急性胃黏膜损伤的重要因素。 2.内毒素血症时胃黏膜COX-2 mRNA、iNOS mRNA表达上调,COX-2、iNOS蛋白表达增强。PAF受体拮抗剂可改善COX-2的表达,下调iNOS表达水平,在减轻急性胃黏膜损伤的同时可能有助于胃黏膜损伤的愈合。内毒素血症时胃黏膜PGE_2下降,NO含量增高,诱发急性胃黏膜损伤;PAF受体拮抗剂可影响胃黏膜PGE_2浓度、NO含量,有助于其发挥对胃黏膜的保护作用。 3.内毒素血症时胃黏膜PCNA表达减少,胃黏膜损伤恢复PCNA表达也增加;胃黏膜pS2 mRNA、TGF-αmRNA表达上调,pS2、TGF-α蛋白表达增强,可能通过介导细胞增殖参与急性胃黏膜损伤的保护和修复。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R725.7

【参考文献】