miR-129靶向Smad3介导IHH信号通路参与调控DDH髋臼顶壁软骨骨化延迟的机制研究

发布时间：2020-04-12 00:03

【摘要】：背景和目的:发育性髋臼发育不良(DDH)是小儿骨科最常见的先天性畸形,致残率高,病因不清。既往DDH病因研究主要集中在Y型软骨,近期我们的3D-CT和MRI研究证实DDH患儿髋臼顶壁存在软骨骨化异常,但其具体机制尚不明确。研究表明microRNA对于软骨细胞增殖、分化以及软骨骨化的调控具有重要作用,但其在DDH的研究尚无报道。本课题拟通过伸直襁褓体位构建DDH动物模型,表达谱芯片分析髋臼顶壁软骨microRNA异常表达,生物信息学预测其靶基因,体外细胞实验论证microRNA及其靶基因信号通路参与调控DDH髋臼顶壁软骨骨化延迟的分子生物学机制。方法:(1)使用4周龄兔进行左下肢石膏固定模拟伸直襁褓体位建立髋臼发育不良模型,以对侧髋作为对照,通过X线检测评判是否造模成功;(2)通过X线、MRI、组织大体标本和番红O-快绿染色检测髋臼顶壁软骨的异常改变;透射电镜检测细胞器结构改变;(3)对模型组和对照组髋臼顶壁软骨标本进行miRNA差异表达分析,并筛选出与软骨发育密切相关的miRNA进行验证;原位杂交检测miRNA在髋臼顶壁软骨上的表达。(4)兔髋臼软骨细胞分离培养,取第2代细胞进行Ⅱ型胶原免疫荧光染色;(5)荧光素酶表达实验检测筛选的miRNA与下游基因的靶向关系;(6)下调筛选出的miRNA,通过PCR、Western blot检测下游靶基因的表达改变,CCK-8法检测软骨细胞的增殖率。ELISA检测软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖分泌。TUNEL检测软骨细胞凋亡。结果:(1)成功构建髋臼发育不良兔13只,MRI结果提示髋臼顶壁软骨出现骨化异常,番红O-快绿染色发现模型组较对照组髋臼顶壁软骨明显增厚。透射电镜检测显示模型组软骨细胞细胞核碎裂,细胞器减少;(2)miRNA基因芯片及验证表明miR-129在模型组低表达。原位杂交示miR-129髋臼顶壁软骨中表达;(3)软骨细胞呈三角形或梭形贴壁生长。ColⅡ免疫荧光染色见细胞质红色荧光;(4)荧光素酶表达实验证实miR-129靶向调控Smad3;PCR、Western blot证实下调miR-129靶向升高Smad3,导致IHH低表达影响软骨细胞增殖和分化,CCK8软骨细胞增殖率显著降低。ELISA示软骨细胞PG分泌减低,ColⅡ无明显改变。TUNEL示软骨细胞凋亡增加。结论:本课题首次证实miR-129在软骨细胞中表达,低表达miR-129靶向升高Smad3,导致IHH低表达,抑制软骨细胞增殖和分化,软骨细胞出现骨化延迟。miR-129有望成为DDH早期诊断的分子标记物和新的治疗靶点。
【图文】：

软骨细胞的形态学表现

髋臼顶壁软骨番红O-快绿染色(A)对照组；(B)模型组
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R726.8

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 赵小明;王恩波;李建军;周春芳;赵群;张立军;;下肢伸直襁褓体位对髋臼软骨复合体发育影响的实验研究[J];中国当代儿科杂志;2009年10期

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本文编号：2624011