2009年重庆地区肠道病毒71型流行株的分离鉴定及病毒基因特征

发布时间：2020-04-14 01:27

【摘要】： 背景:手足口病(Hand-foot-mouth disease ,HFMD)是由多种肠道病毒引起的一种常见传染病,多发于5岁以下儿童,特别是3岁以下婴幼儿,现已发现20多种肠道病毒可以引起该病,其病原主要为EV71、A组柯萨奇病毒和埃可病毒等肠道病毒。近年来我国部分地区以EV71为主要病原,其神经系统并发症引人关注。重庆地区2008、2009年均出现手足口病流行,本课题前期曾对2009年本地区77例手足口病病原检测显示41例(53%)EV71阳性,6例(8%)CA16阳性,7例(8%)EV71和CA16均阳性,说明EV71为重庆地区手足口病的主要病原。目的:对2009年重庆地区手足口病患儿临床标本的EV71进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同国内外相关EV71毒株序列进行同源性比对及进化分析,以了解重庆地区EV71流行株基因组序列特征及可能的传播来源。方法:(1)采集47例手足口病患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子标本共100份,接种于人横纹肌肉瘤细胞(Human Rhabdomyosarcoma,RD)中进行病毒分离培养,对出现细胞病变(Cytopathic Effect,CPE)的细胞上清,分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测,并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定,将测序结果在NCBI网站进行Blast分析,同时用生物学软件Bioedit同国际标准BrCr株进行序列比对及同源性分析,同时电镜观察引起细胞病变的病毒形态,以确定所分离的肠道病毒(enteroviruses,EV)的病原EV71。 (2)将鉴定后的2009年重庆地区EV71流行株基因组分4个片段进行RT-PCR扩增,PCR扩增产物纯化后进行基因测序,测序结果拼接成全长基因组序列,利用生物信息学软件对2009年重庆地区EV71流行株序列进行核苷酸、氨基酸比对分析,分析基因亚型并绘制进化树,以鉴定毒株遗传流行变异情况及可能的传播来源。结果:(1)47例HFMD患儿的100份临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有4份呈EV通用引物阳性,有3份EV特异性引物及EV71特异性引物均阳性,而所有标本CA16特异性引物检测均为阴性,EV71特异性引物PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为20~30nm的圆形无包膜病毒颗粒,与已报道典型的EV71形态相同,证实所分离病毒为EV71。(2)测序获得的3株重庆地区EV71流行株病毒基因组全长分别为7409nt、7406nt和7404nt,3株间VP1氨基酸序列同源性达99%以上,Blast分析表明Chongqing2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China(GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性最高,达97% ; Chongqing-1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离的984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,达96%。3株EV71的VP1氨基酸序列与国内C4亚型代表株AF302996(SHZH98)同源性高达91%以上,证明为C4基因亚型,同时进化树分析也显示其属于C4基因亚型。结论:(1)本研究成功分离2009年重庆地区EV71流行株。 (2)本实验获得的3株重庆地区EV71病毒基因亚型是C4。
【图文】：

结构示意图,流行株,手足口病,隐性感染

图 3. EV71 的结构示意图Figure 3. The structure diagram of EV71龄均可感染，成人和大年龄儿童主要为隐性感染，，发病症感染多见于婴幼儿。无疫苗、药物等特异性的防控手感染和轻症病例多，传染源难以发现和控制，传播途径了解重庆地区 2009 年 EV71 流行株的特点，为重庆地区流行病监控资料。本研究共收集 2009 年手足口病临床标分离及鉴定，以明确本地区 EV71 流行株的特点。法

病毒感染,细胞病变,特异性引物,肠道病毒

A出现细胞病变，说明分离到病毒。在倒置显微镜下与正常RD细胞比较，特点为细胞变圆脱落。经传代后上述细胞病变24h持续出现，提示得到纯化病毒株（图4）。。2.2 采用肠道病毒通用引物、CA16 特异性引物及 EV71 特异性引物RT-PCR 检测分离出的病毒对7株引起细胞病变的阳性毒株采用肠道病毒通用引物及CA16 、EV71 特异性引物进行RT-PCR扩增，其中3株阳性毒株检测出EV71病毒的226 bp特异核酸片段及116 bp EV特异性核酸片段（见图A），另外4株阳性毒株检出116 bp EV特异性核酸片段（见图B）。图5 EV、EV71及CA16特异引物的扩增结果Figure 5 The results for PCR amplification by using enterovirus universalprimers and CA16、EV71-specific primersM DL2000 Marker;A、B中1-5分别为EV扩增结果，A图中1为已分离EV71阳性对照，2-4为本次分离阳性EV71株；5为水对照；6-10依次为本次分离阳性样本EV71扩增结果，11-15为CA16引物扩增结果，B图中2-5为本次分离EV阳性株扩增结果，1为水对照。A:正常的 RD 细胞（对照）；B：病毒感染的 RD 细胞图 4：病毒感染及未感染的 RD 细胞（×200）Figure 4: Virus infection RD cells and uninfected RD cells (× 200)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R725.1

【引证文献】