Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程的关键基因

发布时间：2020-04-15 06:25

【摘要】： 心脏锥干部畸形是常见的复杂性先天性心脏病(先心病),是导致儿童死亡的主要原因之一。近端流出道隔对锥干部的发育至关重要。细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)基因敲除(Cx43KO)小鼠心脏锥干部发育畸形,流出道梗阻,生后即出现死亡,表明Cx43在心脏流出道发育过程中起着重要作用。Cx43是连接蛋白家族中的重要一员,作为一种重要的通讯连接,是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础。近年来发现“心肌化”过程是心脏近端流出道隔发育中的一个重要事件。调控心肌化的基因及相关分子机制的研究正在成为研究热点。本课题组先前的研究发现Cx43KO小鼠心脏近端流出道隔心肌化过程异常,提示复杂的分子机制参与心脏流出道梗阻的发生。为此,本课题拟研究Cx43KO小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43KO小鼠心脏流出道梗阻的关键基因,进一步阐述Cx43KO小鼠心脏流出道梗阻的发病机制。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心脏发育心肌化过程中的形态学研究 研究目的 利用Cx43基因敲除小鼠模型,探讨Cx43基因敲除小鼠与野生型小鼠在心脏心肌化发育过程中的形态学差异。 材料与方法 成年2月龄Cx43基因敲除杂合子小鼠交配,选取ED11.5～15.5的胎鼠以及新生小鼠为研究对象,根据基因型分为Cx43基因敲除纯合子(Cx43-/-),杂合子(Cx43+/-)及野生型(Cx43+/+),采用PCR方法鉴定基因型。显微解剖及HE染色观察心脏结构;免疫组织化学法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA的表达。 结果 1.所有Cx43-/-小鼠出生后很快死亡,其心脏大体解剖上可见右室流出道圆锥部明显膨出。Cx43+/-新生鼠心脏无明显异常。 2.组织切片HE染色显示,出生后死亡的Cx43-/-小鼠右室流出道圆锥部组织异常增生,小梁间囊明显,结构排列紊乱,流出道狭窄,右室壁心肌致密层的厚度较野生型变薄。Cx43+/-新生鼠心脏无明显异常。 3.野生型胎鼠心脏近端流出道垫组织于ED11.5开始有融合趋势,ED13.5完成融合;心肌化过程从ED12.5开始,ED15.5完成。整个心肌化过程呈现心肌由流出道隔外侧向内侧延伸的趋势。而在Cx43-/-胎鼠,α-SCA在近端流出道垫组织的表达减少,尤其是在ED13.5～15.5为著,说明心肌化过程延迟。Cx43+/-的变化不明显。 小结 1.Cx43-/-小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要表型特征。 2.Cx43-/-小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞。 第二部分Cx43基因敲除胎鼠心肌化过程中心脏流出道组织基因表达谱的变化 研究目的 观察Cx43-/-小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的相关基因。 材料与方法 以ED14.5的Cx43-/-和Cx43+/+胎鼠心脏近端流出道部为研究材料,分别提取总RNA,逆转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Afymetrix 430 2.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。 结果 1.与Cx43+/+组相比较,Cx43-/-组中表达上调2倍以上的基因共有143个,表达下调2倍以上的基因有235个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期等主要生理过程。 2.进一步筛查发现,TGFβ/BMP信号通路上的5个基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等与心肌化过程相关的3个基因在Cx43-/-组有明显变化。 小结 1.Cx43基因敲除后可以引起多个基因的表达异常,其中包括与流出道发育密切相关的一些基因。 2.Cx43-/-胎鼠心脏流出道组织中TGFβ/BMP信号通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2,及Bmpr2等基因以及与心肌化过程相关的Ssr1,Ptk2,Bmp6等基因的差异表达可能与其流出道梗阻的发生相关。 第三部分Realtime RT-PCR验证关键基因的差异表达 研究目的 对第二部分筛选出TGFβ/BMP信号通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2及Bmpr2等5个基因以及与心肌化过程相关的Ssr1,Ptk2,Bmp6等3个基因在内的共8个关键基因进行Realtime RT-PCR验证,验证其变化趋势是否与基因芯片结果相同。 材料及方法 以ED14.5的Cx43-/-和Cx43+/+胎鼠心脏近端流出道部为研究材料,分别提取总RNA,逆转录成cDNA;对芯片检测中发现的差异表达的5个TGFβ/BMP信号通路上的基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等与心肌化过程相关的基因,在ED14.5利用Realtime RT-PCR进行验证。 结果 1.Realtime RT-PCR验证其中的5个基因包括TGFβ2,Ssr1、RhoA、Bmp6、Ptk2的变化,表达量明显上调,表明其变化趋势基本与基因芯片结果相同。 2.Realtime RT-PCR验证其中的3个基因包括Bmpr2、Bmp2、smad6的变化,表达量明显下调,表明其变化趋势基本与基因芯片结果相同。 小结 对第二部分筛选出TGFβ/BMP信号通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2及Bmpr2等5个基因以及与心肌化过程相关的Ssr1,Ptk2,Bmp6等3个基因在内的8个关键基因进行Realtime RT-PCR验证,其变化趋势与基因芯片的结果一致。 总结 Cx43基因敲除纯合子小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞,提示Cx43在心肌化的发生过程中起着重要作用。利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43-/-胎鼠TGFβ/BMP信号通路上的5个基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等与心肌化过程相关的多个基因差异表达,并行Realtime RT-PCR验证。这些关键基因的表达异常可能与Cx43-/-小鼠心脏流出道梗阻的发生有关。
【图文】：

四、Cx43一八胎鼠心脏流出道组织中差异表达的关键基因的荧光定量PCR验证对基因芯片所筛选出的表达差异的关键基因进行荧光定量PCR验证，，验证结果与芯片筛查的结果一致，具体变化趋势见表3一1及图3一4。攀O·8泰。.。二二_.“..-.一 一一 一一「「一 一一 一冬冬冬 冬鑫 鑫 ttt一 一 一一 ttttttttttt....... .................矜 矜 矜 ttttttttttttttttttttttt爵 爵 爵 爵 爵 爵 爵爵 }}}}} TGFp2RhoABmPrZ口Cx4;弘/十.Cx43一/- BmPZSmad6BmP6SsrlPtkZ各基因名称图3一4荧光定量PCR验证关键基因表达差异倍数(En145两组间相比较
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R725.4

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本文编号：2628243