TRAIL及受体在少突胶质细胞发育中的表达及在诱导0PC凋亡中的作用

发布时间：2020-04-23 07:08

【摘要】：早产儿脑白质损伤是导致早产儿死亡和神经系统后遗症的重要原因,严重危害早产儿的生存质量,目前尚缺乏有效的防治措施。少突胶质细胞的前体细胞(OPC)是早产儿脑白质损伤的主要靶细胞,凋亡是OPC死亡的主要形式。死亡受体途径是OPC的凋亡的主要途径；该途径由肿瘤坏死因子超家族介导。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员,近年来研究发现TRAIL及其受体在正常细胞广泛表达,并参与细胞的存活和免疫监视,因而备受关注。该受体在神经系统中的研究主要集中在脱髓鞘疾病,目前尚缺乏TRAIL受体表达调控对少突胶质细胞保护作用的研究,也缺少TRAIL及其受体在发育中脑白质损伤中的作用的研究报道。因此,进一步探索TRAIL及其受体在少突胶质细胞发育中的作用,以及调控TRAIL受体对少突胶质细胞的保护作用,将有助于我们更好的理解早产儿脑白质损伤的发病机制,为更有效地防治早产儿脑损伤提供新的思路。第一部分人少突胶质系细胞体外扩增培养及分化鉴定应用条件限定培养基培养方法对人少突胶质前体细胞株(HOPC)进行培养。通过免疫组织化学方法培养细胞的进行鉴定。人少突胶质祖细胞PDGFRα荧光标记阳性,人前少突胶质细胞O4荧光标记阳性,人未成熟少突胶质细胞O1荧光标记阳性,成熟少突胶质细胞MBP荧光标记阳性。通过流式细胞术对培养细胞的纯度进行鉴定,少突胶质祖细胞组中PDGFRα(+)/O4(-)细胞的百分比为97.06%；前少突胶质细胞组中04(+)/O1(-)细胞的百分比为96.01%；未成熟少突胶质细胞组中04(+)/O1(+)细胞的百分比为95.3%；成熟少突胶质细胞组中MBP(+)细胞的百分比为91.6%。我们选用的HOPCs具有少突胶质祖细胞形态学和生物学特点；通过不同的条件限定培养基,HOPCs可以分化为前少突胶质细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞；通过此方法可获得高纯度的少突胶质祖细胞、前少突胶质细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞。第二部分TRAIL及受体在少突胶质细胞发育中的表达及作用既然我们获得了高纯度的少突胶质祖细胞、前少突胶质细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞,通过RT-PCR及Western blot 2种方法,分别从mRNA水平和蛋白水平检测4组处于不同发育阶段中的人少突胶质细胞表面TRAIL及其受体的表达情况。在不同发育阶段的4组人少突胶质细胞上均未检测到TRAIL的表达,但是4组细胞的表面均可检测到TRAIL受体的表达。不同发育阶段的人少突胶质细胞表面的TRAIL受体的表达存在差异性。TRAIL-R1和TRAIL-R2在人少突胶质祖细胞及前体细胞呈现出高表达性；而TRAIL-R3和TRAIL-R4则主要表达在未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞的表面。再分别给予不同发育阶段的4组人少突胶质系细胞以不同浓度的重组可溶性TRAIL刺激后(2 ng/ml; 20 ng/ml; 200 ng/ml及2000 ng/ml),通过流式细胞术(Annexin V-FITC和PI)观察细胞的凋亡情况。随着TRAIL浓度的增加,各组细胞的凋亡率呈现逐渐增加的趋势；TRAIL对少突胶质系细胞的损伤作用呈现明显的量—效关系和成熟依赖性。TRAIL主要诱导少突胶质祖细胞和前少突胶质细胞凋亡。TRAIL诱导少突胶质系细胞的凋亡主要发生在TRAIL刺激后的24-48 h。第三部分下调DR4/DR5,上调DcRl/DcR2对OPC的保护作用我们发现TRAIL受体在少突胶质细胞发育过程中的表达存在差异,TRAIL诱导少突胶质系细胞的凋亡呈现量-效关系和成熟依赖性。于是我们进一步探索调控TRAIL受体是否对OPC具有保护作用。采用小分子siRNA干扰下调少突胶质祖细胞上的TRAIL-DR4/DR5的表达；采用pcDNA3.1慢病毒包埋上调少突胶质祖细胞上的TRAIL-DcRl/DcR2的表达。分别给予siRNA-DR4组、siRNA-DR5组、pcDNA3.1-DcRl组和pcDNA3.1-DcR2组细胞,4组细胞以不同浓度的重组可溶性TRAIL (2 ng/ml; 20 ng/ml; 200 ng/ml及2000 ng/ml)刺激后,通过流式细胞术观察各组细胞的凋亡情况。在siRNA-DR4组和pcDNA3.1-DcR2组,TRAIL介导其发生凋亡的百分比明显下降,且差异具有显著性。TRAIL介导细胞凋亡主要发生在TRAIL干预后的24 h-48 h。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R722.6

【参考文献】