siRNA抑制HO-1表达以治疗新生期高胆红素血症的研究

发布时间：2020-04-24 20:04

【摘要】： 新生儿黄疸是新生儿期临床常见病症,由胆红素产生和排泄失衡所致,发生率较高,约占新生儿的2/3。胆红素对神经系统有损害,严重黄疸者可引起胆红素中毒性脑病,约占新生儿黄疸的0.5~2%,造成儿童智力障碍甚至死亡,有很高的致死率或致残率。血红素加氧酶(Heme Oxygenase, HO)是血红素代谢为胆红素的限速酶,其中HO-1可被多种因素诱导。本课题先通过RNA干扰技术在体外BRL细胞水平特异下调HO-1基因的表达,探讨通过降低HO-1表达以阻断胆红素产生;然后用有效的siRNA注射新生鼠黄疸模型降低胆红素生成,以期寻找出一条新的早期防治新生儿高胆红素血症及胆红素中毒性脑病新的有效途径。针对大鼠HO-1基因设计并化学合成四组小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)。用INTERFERin转染试剂转染FAM标记的siRNA,流式细胞仪检测转染效率可达90%。通过RT-PCR筛选出具最佳抑制效果的序列——siRNA-4,10nM siRNA转染24h后RT-PCR检测抑制效率77%;siRNA-1、2也有一定程度的抑制。siRNA-4对于HO-1基因的最佳作用浓度为10 nM,mRNA水平抑制最佳作用时间为24 h。体外经浓度梯度、时间梯度检测证实3μg/mL血红素刺激,就能诱导HO-1高表达,18 h诱导效果最好。siRNA-4亦可降低被诱导HO-1蛋白表达,实验证实最佳作用时间36 h,抑制效率可达64%。我们通过对7~10天龄SD大鼠3次腹腔注射50μM(/100 g体重)ALA能诱导HO-1表达和血清胆红素生成,HO-1升高到原来3倍,总胆、直胆。间胆浓度都升高,依此构建新生鼠黄疸模型。此模型大鼠经腹腔注射半甲氧基修饰的siRNA-4,实验证实5 OD/(20 g体重)剂量siRNA-4注射2 d后对总胆红素抑制效率43%,10 OD/(20 g体重)抑制效率50%;HO-1蛋白抑制效率各为30%和42%。5 OD/(20 g体重)剂量注射时,最后一次注射后1天、2天、3天总胆红素的降低效果分别是36%、45%、27%,HO-1蛋白抑制效果分别是26%、33%、18%。体外、体内实验表明,运用分子生物学技术设计合成的siRNA-4能够有效抑制干扰HO-1基因表达,进而减少胆红素产生,为早期防治新生儿黄疸和胆红素中毒性脑病提供了一条新的有效途径依据。
【图文】：

途径,氨基酸残基,血红素

图 1. 胆红素代谢途径[13]Figure 1. Bilirubin metabolic pathway在胆红素代谢过程中，从血红素经过两部反应生成胆红素，限速酶是血红素氧化酶。至今已发现三种 HO 同工酶：HO-1、HO-2 和 HO-3[14-16]。三种异构体虽然在氨基酸序列及诱导性上有所不同，但具有共同的催化底物，催化机制及反应产物。HO-1 分子量为 33 kDa，由 288 个氨基酸残基构成，为热休克蛋白 32（HSP32）。血红素、金属元素、氧化应激、紫外照射、高温、某些特定药物以及还原型谷胱甘肽等均能诱导 HO-1，而且研究发现 HO-1 在肝脏和脾脏中浓度最高。Shibahara S 等报道人与大鼠 HO-1 基因的同源性为 80％[17]。HO-2 由 361个氨基酸残基构成，分子量为 36 kDa。研究表明 HO-2 和 HO-1 是两种不同的基因产物，基因序列同源性仅 40％。HO-2 的 N-末端较 HO-1 多 20 个氨基酸残基，两者的 C-末端都有疏水序列，该序列的末端分别与微粒体膜相连。与 HO-1 相反，，HO-2 不被外因诱导，在脑和睾丸中浓度最高。HO-3 是一个约 2.4 kb 的单一转录

序列,反义链,结构域,异常的

目前认为 RNA 干扰的机制可能是由于外源性 RNA 病毒入侵或转座子等原因，使宿主细胞中出现异常的双链 RNA 分子（dsRNAs）[50]。这些异常的 dsRNAs在 Dicer 酶的作用下，能被特异的切割成为分子量约～22nt 的小干扰 RNA（smallinterfering RNAs，siRNAs）。这些小的 siRNAs 可作为导向序列，引导其反义链与单链靶 mRNA 结合，共同形成 RNA 诱导的沉默复合物（RNAinduced silencingcomplex，RISC）。其反义链与对应同源的靶 mRNA 结合，有意义链解离出来，宿主 mRNA 被降解，同时释放出 Dicer 酶。然后不断重复这一过程，特异性降解下一个对应的 mRNA[51]。其中 Dicer 酶的作用很重要也是必不可少的。现认为它是 RNAse Ⅲ家族的成员之一。它包括一个螺旋结构域、两个 RNA 酶Ⅲ结构域、两个 dsRNA 结合域以及一个 PAZ 结构域。在植物、线虫、果蝇和哺乳动物体内均存在 Dicer 酶的同源体，这些蛋白结构相似，具有相似的生化功能，说明 RNA干扰这种调节具有进化保守的结构基础，进一步提示它可能是生物体的一种进化保守机制[52]。图 2 是 RNA 干扰机制的简单示意图。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R722.1

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