【摘要】：目的比较物理训练和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)对新生期大鼠反复长程惊厥所致神经行为损伤的干预效应及分子机制。 方法出生6d(Postnatal day 6,用P6表示,下同)的健康Sprague-Dawley(SD)大鼠75只,随机分为5组,对照组(control,CON组,n=15)、对照水疗组(control and hydrotherapy,HCON组,n=15)、惊厥组(Recurrent neonatal seizures,RS组,n=15)、惊厥水疗组(Recurrent neonatal seizures and hydrotherapy,HRS组,n=15),3-MA组(3-MA组,n=15)。RS组、HRS组及3-MA组在P6吸入三氟乙醚诱导惊厥发作,持续30分钟,连续6天,CON及HCON组同样操作但不吸入三氟乙醚,其中3-MA组在每日开始惊厥前15min腹腔注射3-MA。于末次惊厥后第2天(即P12)对HCON及HRS组采用物理训练(泡泡浴水疗)进行干预,连续28天。检测五组大鼠生长发育(体重、门齿萌出、竖耳、睁眼),P12、P17进行游泳行为评分,P17、P26、P33、P40进行神经行为学评分(前肢悬吊实验、负向趋地反应实验、旷场实验)。P42每组各取6只采用Timm染色法观测各组大鼠海马区苔藓纤维发芽。余大鼠(n=9/每组)于P43～P49行Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能。于P50取海马及大脑皮质组织,采用免疫印迹技术(Western blot)检测可塑性相关基因-1(plasticity related gene 1,PRG-1)、抗凋亡基因Bcl-2及自噬标记蛋白LC3、Beclin1的表达。 结果1、生长发育RS组各日龄体重较CON组明显降低(P㩳0.01);HRS组(P26、P33、P40)体重较RS组显著升高(P㩳0.05),3-MA组(P12、P14、P18)体重较RS组显著升高(P㩳0.05)。各组生理发育现象(门齿萌出、竖耳、睁眼)出现时间无显著性差异。 2、神经行为学(1)游泳评分:RS组游泳实验评分(P12、P17)明显低于CON组(P㩳0.05);HRS组游泳实验评分(P12、P17)与RS组比较无明显差异(P㧐0.05),3-MA组游泳实验评分(P12、P17)与RS组相比明显提高(P㩳0.05)。(2)前肢悬吊实验显示:各组大鼠不同日龄前肢悬吊时间比较无显著性差异(P㧐0.05)。(3)负向趋地反应实验显示:RS组不同日龄负向趋地反应时间较CON组明显延长(P㩳0.05);HRS组不同日龄负向趋地反应时间与RS组比较无显著性差异(P㧐0.05),而3-MA组不同日龄负向趋地反应时间较RS组明显降低(P㩳0.05)。(4)旷场实验显示:RS组(P17、P26、P33)旷场得分较CON组明显降低(P㩳0.05);HRS组旷场得分(P26、P33、P40)较RS组明显升高(P㩳0.05),同时3-MA组旷场得分(P17、P26)较RS组明显升高(P㩳0.05)。 3、学习记忆能力Morris水迷宫实验显示:(1)逃避潜伏期:五组大鼠逃避潜伏期于测试第1天至第5天逐渐缩短,RS组第4、5天逃避潜伏期较CON组明显延长(P㩳0.05);HRS组第4天逃避潜伏期较RS组明显缩短(P㩳0.05),同时3-MA组第4、5天逃避潜伏期亦明显短于RS组(P㩳0.05)。(2)搜寻策略:RS组第4、5天成绩较CON组、HRS组及3-MA组差,具有统计学意义(P㩳0.05)。(3)空间探索测试:各组间穿越平台次数无明显差异(P㧐0.05)。 4、Neo-Timm染色:RS组大鼠海马齿状回内分子层及CA3区始层可见明显异常增生苔藓纤维;HRS组CA3区苔藓纤维发芽程度较RS组明显降低(P㩳0.05),而3-MA组CA3区及齿状回苔藓纤维发芽程度均较RS组降低(P㩳0.05);CON组及HCON组未见明显发芽。 5、免疫印迹:(1)RS组海马及大脑皮质PRG-1表达水平较CON组明显升高(P㩳0.05);HRS组PRG-1表达水平与RS组相比无显著性差异(P㧐0.05),但是3-MA组海马及大脑皮质PRG-1的表达较RS组明显降低(P㩳0.05)。(2)RS组海马及大脑皮质Bcl-2表达水平较CON组明显降低(P㩳0.05);HRS组海马及大脑皮质Bcl-2表达水平较RS组显著升高(P㩳0.05),3-MA组海马Bcl-2表达水平较RS组显著升高(P㩳0.05)。(3)各组大鼠海马及大脑皮质LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的值及Beclin1的表达无显著性差异(P㧐0.05)。 结论1、新生期三氟乙醚诱导大鼠反复长程惊厥导致生长发育、神经行为及学习能力损伤,同时造成海马苔藓纤维异常发芽以及大脑皮质与海马PRG-1表达升高、Bcl-2表达降低。 2、惊厥后早期采用物理训练(泡泡浴水疗)进行干预,能促进大鼠体重增长,改善惊厥所致情感认知及学习能力损害,但对神经反应性损伤干预效果不明显。泡泡浴水疗能减轻惊厥后海马苔藓纤维异常发芽程度,显著上调海马与大脑皮质Bcl-2的表达,但对海马及大脑皮质PRG-1的表达无明显干预作用。 3、惊厥发作前应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤能明显改善惊厥所致体重降低、神经行为异常及情感认知和学习能力损害。显著抑制惊厥后海马苔藓纤维异常增生发芽,明显下调海马及大脑皮质PRG-1的表达、上调海马Bcl-2的表达。 4、本研究表明,物理训练(泡泡浴水疗)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对新生期惊厥性脑损伤均有干预作用,而3-甲基腺嘌呤的干预效应更加显著。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R722.1
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2 杨s，
本文编号：2642172
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