新生兔缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的基础与影像学实验研究

发布时间：2020-05-10 20:49

【摘要】： 前言新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于新生儿窒息，引起脑血供和气体交换障碍所致的一种全脑性损伤，是严重危害新生儿生命健康的疾病，有较高的发病率和死亡率，也是造成儿童智能低下、脑瘫等神经系统残疾的重要原因之一。HIBD的发病原因及发病机制较为复杂，越来越多的证据表明，细胞凋亡(Apoptosis)也参与HIBD，并在其中发挥独特的作用。神经元细胞凋亡的发生与患儿的预后有着密切的联系。了解新生儿缺氧缺血性脑损伤后各部位神经元形态结构在疾病过程中的动态变化情况，从而在病理解剖、超微结构层面认识神经元细胞凋亡的系列变化，有助于加深对新生儿缺氧缺血性脑损伤疾病发生、发展的深入研究；在分子水平，细胞凋亡过程受到多种基因及细胞因子的调控，Bcl-2家族是研究的热点，其中Bax和Bcl-2的相对比值在细胞凋亡中起着重要作用；并且由于分子生物学、放射化学、各种诊断设备的飞速发展，使得分子影像学细胞凋亡显像技术在HIBD中的应用得以建立、发展和逐步扩大，其中典型代表为“annexin V(膜联蛋白V)”核素凋亡显像，这种以反映组织器官分子功能信息为特长的影像诊断模式在HIBD实验研究与应用正逐渐受到临床关注和重视。本实验通过建立新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，对损伤后不同时间点各组动物患侧脑组织进行病理组织学光镜、电镜动态观察，利用TUNEL染色和免疫组织化学手段观察脑组织中凋亡细胞及其调控蛋白的动态表达规律，并应用~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V进行活体放射性核素凋亡显像，探讨新生兔缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的形态学动态变化、凋亡调控蛋白动态表达规律及其活体核素凋亡显像的可行性，为新生儿缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡的基础与影像学研究提供动物实验依据。实验材料一、实验动物新生8～10天健康日本大耳白兔，雌雄不限，体重100～120g，由中国医科大学附属第二医院实验动物部提供。二、实验试剂 5％盐酸利多卡因，20％乌拉坦(氨基甲酸乙酯)，乙醚，医用纯氧气和纯氮气，4％多聚甲醛溶液，0.1M磷酸缓冲液，过氧化氢，不同浓度酒精，二甲苯，中性树胶。TTC(红四氮唑)，2.5％戊二醛，1％锇酸，Epon812(环氧树脂)(论文一)；兔抗兔Bcl-2和Bax多克隆抗体(一抗)、SABC试剂盒、TUNEL试剂盒和DAB染色液(论文二)；~(99m)TcO_4~-，Annenxin V，Sn~(2+)-Tricine Kit和HYNIC(联肼尼克酰胺)-Annexin V Kit(论文三)。三、实验仪器缺氧箱，石蜡切片机，电子天平(ER-185A)，Olympus光学显微镜，JEM-1200EX电镜，CY-100数字测氧仪，GE Infinia ~(VC) Hawkeye双探头SPECT／CT，Philip 3.0T磁共振。实验方法按照Rice法制备新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，即用乙醚吸入麻醉动物，5％盐酸利多卡因局部浸润麻醉，颈部正中切口，剥离右侧颈总动脉和迷走神经，用2号缝线将剥离出的右侧颈总动脉作永久结扎。将动物置于自制的常压有机玻璃缺氧箱，输入的8％氧气和92％氮气，由测氧仪监控，使箱内氧浓度维持在8％左右，持续低氧处理2.5h，即制成新生兔缺氧缺血性脑损伤动物模型。假手术对照组动物仅剥离右侧颈总动脉，不做结扎和缺氧处理。论文一：按上述方法制备新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，将实验动物按缺氧缺血后不同时间点分成6组：(1)假手术对照组n=7；(2)HIBD 1h组n=5；(3)HIBD 4h组n=5；(4)HIBD 12h组n=5；(5)HIBD 24h组n=5；(6)HIBD 48h组n=7。观察各组实验动物处理过程中的行为变化情况；到达规定时间后，各组动物经4％多聚甲醛心脏灌流后断头取脑，取脑时观察脑组织大体标本情况；取假手术组和HIBD 48h组动物各2只断头取脑行TTC染色，观察有无肉眼可见的梗死灶；每组3只动物脑组织标本常规脱水、透明、石蜡包埋，冠状切片、片厚5μm，制作HE染色切片，观察右侧脑组织光镜病理学变化；每组2只动物取右侧大脑皮质、海马和小脑皮质，脑组织标本经2.5％戊二醛固定、1％锇酸固定、酒精梯度脱水、Epon812包埋、超薄切片，透视电镜下摄片，观察脑组织超微结构变化。论文二：制备新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，将实验动物分成6组：(1)假手术对照组n=5；(2)HIBD 1h组n=5；(3)HIBD 4h组n=5；(4)HIBD 12h组n=5；(5)HIBD 24h组n=5；(6)HIBD 48h组n=5。各组动物经4％多聚甲醛心脏灌流后断头取脑，常规脱水、透明和石蜡包埋。各组取右侧丘脑中1／3平面、小脑位置行冠状切片，切片厚度为5μm，进行TUNEL、Bcl-2和Bax蛋白免疫组化检测，光镜下观察凋亡细胞、Bcl-2和Bax蛋白在各部位动态分布。论文三：制备新生兔缺氧缺血性脑损伤模型，将实验动物分成6组：(1)假手术对照组n=5；(2)HIBD 1h组n=5；(3)HIBD 4h组n=5；(4)HIBD 12h组n=5；(5)HIBD 24h组n=5；(6)HIBD48h组n=5。制备~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V，各组实验动物注射显像剂后1h进行SPECT平面活体凋亡显像；HIBD 48h组动物还分别在注药后5min、30min、60min和120min显像；取HIBD 48h组两只动物，在活体显像之后，断头取脑进行裸脑离体显像。在注射药物后1h，对照组动物进行全身成像，利用ROI技术，分别勾画动物全身、头部、肺部、心脏、肝脏、双肾处感兴趣区，计算上述各部位放射性计数与全身总计数的比值。取假手术组和HIBD 4h组各2只动物，在进行核素显像之后，进行头部T_1、T_2加权MRI和DWI(弥散加权)成像。实验结果论文一：实验组动物缺血缺氧处理后5min出现烦躁不安，20min时出现呼吸加深加快，鼻翼煽动，40min至90min时出现嗜睡，爬行时左后肢呈拖步，90min至2.5h时嗜睡明显，部分动物出现短暂性抽搐；假手术组动物活动状态无明显改变。假手术对照组、HIBD 1h组、HIBD 4h组两侧大小脑半球未见明显异常改变，HIBD 12h组可见右侧大小脑半球与对侧相比，颜色苍白，呈轻度肿胀，软脑膜下见轻度出血改变，HIBD 24h组和HIBD 48h组见右侧大小脑半球肿胀明显，颜色较苍白，软脑膜下出血征象明显，而对侧大小脑半球未见明显异常。TTC染色动物脑切面组织均染成玫瑰红色。HE染色光镜观察结果：对照组未见异常改变；患侧大脑皮质在HIBD 12h组、海马在HIBD 24h组、小脑皮质在HIBD 4h组可见典型凋亡细胞形态；HIBD 48h组患侧大脑皮质、海马区及小脑皮质凋亡细胞数明显增加。电镜超微结构形态学观察：小脑皮质最先在HIBD 1h出现凋亡征象，其次为大脑皮质在HIBD 12h、海马CA1区在HIBD 24h出现凋亡细胞超微结构明显改变，随损伤时程进展各部位细胞超微结构改变明显，细胞器损伤加重。论文二：TUNEL法检测HIBD后不同时间点凋亡细胞的动态变化，光镜下分别观察并计数各组TUNEL法染色切片，标记阳性细胞的细胞核着棕黄色，胞浆不着色。假手术对照组大脑皮质、海马区和小脑皮质未见明显TUNEL标记阳性细胞表达；患侧大脑皮质在HIBD 12h TUNEL标记阳性细胞表达明显；患侧海马CA1区在HIBD 24h TUNEL标记阳性细胞表达明显；患侧小脑皮质在HIBD 4hTUNEL标记阳性细胞表达明显。缺氧缺血后时间随时间推移阳性标记细胞逐渐增多，至HIBD 48h各部位阳性标记细胞数达到最多。免疫组化检测HIBD后不同时间点脑组织凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的动态变化，光镜分别观察Bcl-2和Bax免疫组化切片，免疫组化检测蛋白表达阳性细胞为胞浆着棕黄色，胞浆未着色者为阴性表达。 (一)免疫组织化学检测Bcl-2蛋白表达情况假手术对照组患侧大脑皮质、海马区和小脑皮质未见明显Bcl-2蛋白表达；患侧大脑皮质在HIBD 4h Bcl-2蛋白表达明显(阳性表达细胞计数为88.4±1.9)，于HIBD 48h表达明显减少；患侧海马CA1区在HIBD 4h Bcl-2蛋白表达明显(阳性表达细胞计数为73.6±3.2)，于HIBD 48h表达明显减少；患侧小脑皮质在HIBD 1h Bcl-2蛋白表达明显(阳性表达细胞计数为93.6±5.08)，于HIBD 48h表达明显减少，P均＜0.05。 (二)免疫组织化学检测Bax蛋白表达情况假手术对照组患侧大脑皮质、海马区和小脑皮质未见明显Bax蛋白表达；患侧大脑皮质Bax蛋白在HIBD 1h表达较少，在HIBD 12h表达明显增多(阳性表达细胞计数为65.6±14.3)；患侧海马CA1区Bax蛋白表达在HIBD 1h表达较少，，在HIBD 24h表达明显增多(阳性表达细胞计数为76.4±12.0)；患侧小脑皮质Bax蛋白在HIBD 1h表达较少，在HIBD 4h表达明显增多(阳性表达细胞计数为53±6.7)；缺氧缺血后随时间推移，HIBD 48h时各部位阳性标记细胞数达到最多，P均＜0.05。论文三：假手术组动物~(99m)Tc-HYNIC-AnnexinV活体凋亡显像未发现两侧大脑区域有异常放射性浓聚，HIBD 4h组动物显像发现右侧大脑(患侧)局限性放射性轻度浓聚，而对侧呈放射性本底影；HIBD 48h组右侧大脑见明显放射性异常浓聚，对侧未见异常放射性分布；HIBD 48h组裸脑离体核素凋亡显像仅见右侧大脑放射性浓聚明显，左侧大脑呈放射性空白分布。HIBD 48h组在注射显像剂后不同时间显像发现注药后大约5min显像时右侧大脑放射性就明显高于对侧，至2h时肉眼观察左右脑放射性分布无明显改变。对假手术对照组动物体内脏器放射性分布研究中发现在注药后1h时，体内脏器以肝脏摄取显像剂最多，其次为肾脏、肺和心脏，头部摄取显像剂最少。MR成像结果：假手术对照组和HIBD 4h组常规MRI显像均未见异常信号，DWI MRI显像及ADC(弥散加权系数)图分析均未见异常改变。结论论文一： 1．对新生兔结扎一侧颈总动脉，给予低氧处理后，可制作成患侧缺氧缺血性脑损伤模型； 2．本研究动物模型属于轻度脑缺氧血性脑损伤模型，观察处理后48h尚未造成患侧大脑明显梗死； 3．病理学动态观察发现患侧小脑皮质对缺氧缺血较为明显，其次为大脑皮质和海马区，上述区域存在凋亡细胞，随损伤后时间推移而明显。 4．电镜超微结构动态观察发现患侧小脑皮质在损伤因素后较早出现细胞凋亡超微结构改变，其次为大脑皮质和海马，电镜可清晰显示各部位损伤后细胞核和细胞器的形态学改变。论文二： 1．在新生兔HIBD模型中，患侧小脑细胞凋亡较早发生，其次为大脑和海马，缺氧缺血后时间随时间推移凋亡细胞数明显增多。 2．在新生兔HIBD模型中，患侧大脑皮质、海马、小脑皮质在HIBD损伤早期Bcl-2蛋白表达明显，但于HIBD 48h表达明显减少，而Bax蛋白表达明显增多，其中小脑Bax蛋白表达明显较早出现，其次为大脑和海马。论文三： 1．核素凋亡显像剂~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V在新生兔HIBD损伤后4h即可出现患侧放射性异常浓聚，提示神经元凋亡的存在；而脑部MRI常规和弥散成像在HIBD 4h未发现异常。 2．利用~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V显像可以对HIBD损伤后细胞凋亡状况进行动态、半定量观察。 3．对于脑部~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V凋亡显像，注射药物后5min显像与注药后2h显像放射性分布并无明显差别，提示脑部凋亡显像早期即可进行。
【图文】：

TTC染色,大脑,玫瑰红,脑组织

假手术对照组，大脑中部冠状切片TTC染色。脑组织颜色均呈玫瑰红色，未见明确白色梗死区域。图2， HIBD48h组，大脑中部冠状切片TTC染色。脑组织颜色均呈玫瑰红色，未见明确白色梗死区域。

TTC染色,大脑,玫瑰,脑组织

假手术对照组，大脑中部冠状切片TTC染色
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R722.1;R817

【相似文献】