雷帕霉素阻断mTOR信号通路抑制病毒性心肌炎心肌纤维化的实验研究

发布时间：2020-05-12 12:53

【摘要】： 目的哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用，本研究用柯萨奇病毒B3m株(coxsackievirus B3m，CVB3m，CVB3)感染体外培养的SD大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞，建立病毒性心肌炎(viral myocarditis，VM)的细胞模型，用雷帕霉素(mpamycin)阻断mTOR信号通路，了解mTOR信号通路在VM心肌纤维化的可能作用机制。 方法取新生SD鼠，用改良法原代培养心肌成纤维细胞和心肌细胞，根据细胞形态和免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定，建立CVB3感染的细胞模型。用mTOR抑制剂——雷帕霉素对细胞模型进行干预，采用RT-PCR、Western Blot、免疫细胞化学染色等方法检测细胞mTOR、eIF-4E、Ⅰ型胶原及Smad3表达，应用SPSS11.5统计软件对数据进行统计学分析，P＜0.05为差别有显著性统计学意义。 结果 (1)用胰蛋白酶与胶原酶合用消化分离心肌细胞，结合2次短时间的差速贴壁，可提高心肌细胞的存活率和搏动率，纯化心肌细胞和心肌成纤维细胞。心肌成纤维细胞抗波形蛋白(vimentin)染色阳性，抗α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)染色阴性；心肌细胞抗α-sarcomeric actin染色阳性，抗vimentin染色阴性。 (2)CVB3感染心肌成纤维细胞，电镜下细胞形态发生改变，胞浆内有病毒颗粒，心肌成纤维细胞CVB3 mRNA持续表达，重复感染率(multiplicity of infection，MOI)为1.0PFU／cell的CVB3可使心肌成纤维细胞发生细胞病变(cytopathic effect，CPE)。CVB3可使原代培养的心肌细胞发生CPE，电镜下细胞形态发生改变，胞浆内有病毒颗粒，培养上清液磷酸肌酸激酶-心型同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)水平增高。 (3)用0nM(对照组)、1nM、10nM、100nM的雷帕霉素干预心肌成纤维细胞48h，RT-PCR测得mTOR／β-actin光密度值分别为1.45±0.04、0.38±0.02、0.28±0.01、0.26±0.01，10nM组和100nM组低于1nM组，差异有显著性(P＜0.05)；10nM组和100nM组比较，差异无显著性(P＞0.05)；用10nM雷帕霉素干预心肌成纤维细胞0小时(对照组)、24h、48h、72h后RT-PCR测得mTOR／β-actin光密度值分别为0.34±0.02、0.20±0.02、0.16±0.02、0.14±0.01，光密度值随雷帕霉素作用时间的延长而降低，各组比较差异均有显著性(P＜0.05)；将MOI分别为0(对照组)、0.2 PFU／cell、0.5 PFU／cell、1.0 PFU／cell的CVB3干预心肌成纤维细胞24 h，用MTT测得其OD值分别为0.36±0.04、0.35±0.05、0.66±0.07、0.32±0.065，MOI为0.5PFU／cell组OD值高于对照组(P＜0.05)；MOI为0.2PFU／cell和1.0PFU／cell组OD值与对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)；用10nM雷帕霉素干预CVB3感染的心肌成纤维细胞，MTT检测其OD值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为0.55±0.09、0.66±0.09、0.42±0.09、0.36±0.12，CVB3组高于对照组，Rap低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (4)RT-PCR检测对照组心肌成纤维细胞mTOR／β-actin光密度值d1、d2、d3分别为：0.36±0.03、0.39±0.02、0.37±0.04，各时间点比较差异均无显著性(P＞0.05)；CVB3组光密度值d1、d2、d3分别为：0.86±0.06、0.97±0.06、0.93±0.06，各时间点比较差异均无显著性(P＞0.05)；CVB3+Rap组d1、d2、d3光密度值分别为：0.26±0.03、0.18±0.02、0.10±0.02，各时间点比较，光密度值随干预时间的延长而降低，d3降低最明显，与d1、d2比较，，差异有显著性(P＜0.05)。CVB3组光密度值各时间点与对照组对应时间点比较，d1开始增加，d2、d3仍可见增加，差异均有显著性(P＜0.05)；CVB3+Rap组光密度值各时间点与CVB3组对应时间点比较降低，差异均有显著性(P＜0.05)；Western Blot检测mTOR蛋白表达，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组mTOR／β-actin灰度值分别为0.22±0.09、0.92±0.13、0.19±0.03、0.20±0.05。CVB3组高于对照组，Rap组低于照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (5)RT-PCR检测心肌成纤维细胞eIF-4E／β-actin光密度值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为：0.73±0.07、0.87±0.03、0.32±0.03、0.56±0.04；Western Blot检测上述各组eIF-4E／β-actin灰度值分别为：0.79±0.09、1.35±0.12、0.55±0.04、0.62+0.07，CVB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (6)RT-PCR检测心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原／β-actin光密度值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为：1.13±0.06、1.30±0.01、0.73±0.03、0.82±0.03，CVB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)；心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性，胞浆呈浅棕黄色，胞核为蓝色。CVB3感染细胞48 h，胞浆呈深棕色，雷帕霉素干预后胞浆颜色变浅。 (7)RT-PCR检测心肌成纤维细胞Smad3／β-actin光密度值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为：0.63±0.06、1.18±0.03、0.35±0.05、0.77±0.08；Western Blot检测上述各组Smad3／β-actin灰度值分别为：0.89±0.07、2.27±0.13、0.36±0.02、0.13±0.01。CVB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (8)RT-PCR检测心肌细胞mTOR／β-actin光密度值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为：0.32±0.08、0.93±0.06、0.15±0.05、0.32±0.08；Western Blot检测上述各组mTOR／β-actin灰度值分别为：0.79±0.11、2.97±0.23、0.45±0.08、1.23±0.19。CVB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (9)RT-PCR检测eIF-4E／β-actin光密度值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为：0.80±0.03、1.21±0.09、0.45±0.04、0.44±0.06；Western Blot检测上述各组eIF-4E／β-actin灰度值分别为：1.22±0.09、2.52±0.31、0.66±0.03、0.99±0.11。CVB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (10)RT-PCR检测心肌细胞Ⅰ型胶原／β-actin光密度值，对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为：0、0.18±0.06、0、0.06±0.02，对照组及Rap组光密度值均为0，CVB3组高于对照组，CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 (11)RT-PCR检测心肌细胞Smad3／β-actin光密度值：对照组、CVB3组、Rap组、CVB3+Rap组分别为0.55±0.04、1.14±0.05、0.41±0.10、0.35±0.07；Western Blot检测上述各组Smad3／β-actin灰度值分别为：0.11±0.01、0.35±0.09、0.06±0.01、0.08±0.02。CVB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(P＜0.05)。 结论 (1)低浓度的胰蛋白酶和胶原酶合用，结合2次差速贴壁分离培养大鼠心肌细胞，可提高心肌细胞的存活率和纯度，使细胞搏动良好。 (2)心肌成纤维细胞可作为CVB3的感染细胞建立VM细胞模型。 (3)雷帕霉素使心肌成纤维细胞内源性mTOR表达下调，在一定剂量内，呈剂量和时间依赖性，mTOR可作为雷帕霉素作用的靶点。 (4)雷帕霉素抑制CVB3诱导的心肌细胞成纤维细胞增殖是通过mTOR／eIF-4E信号通路起作用的。 (5)雷帕霉素抑制CVB3可诱导心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原及Smad3表达，提示mTOR／eIF-4E信号通路与Smad信号通路共同作用，参与CVB3诱导的心肌纤维化过程。 (6)CVB3可诱导心肌细胞Ⅰ型胶原表达，雷帕霉素抑制CVB3诱导的心肌细胞mTOR、eIF-4E、Ⅰ型胶原及Smad3表达，提示心肌细胞在CVB3感染时细胞表型可能发生改变，并通过mTOR／eIF-4E及Smad信号通路在纤维化过程中起一定作用。
【图文】：

mTOR(387bp)100bP图3一2不同浓度雷帕霉素对心肌成纤维细胞 mTORmRNA表达的影响(RT-PCR)l:对照组 ;2:1nM;3:10nM;4:100nM 10nM组和 100nM组抑制作用较InM组强，差异有显著性护<0.05);而 10nM组和100nM组比较，差异无显著性护卜0.05)3.1.2不同时间点雷帕霉素对心肌成纤维细胞mTOR表达的影响用 10IIM雷帕霉素干预心肌成纤维细胞oh(对照组)、24h、48h、72h后RT一pCR检测mToR/p一actin光密度值分别是0.34士0.02、0.2肚0.02、0.1肚0.02、0.1牡0.01。 mTORmRNA表达随雷帕霉素作用时间的增加而降低，差异均有显著性(p<0.05)(见图3一3，34)。 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2abe 0.15华赵娜架巴切几!岌 0.05对照组24h48h72h图3一3不同时间点雷帕霉素对心肌成纤维细胞 mTORmRNA表达的影响(mTOR/卜actin光密度值)经方差分析和￡阿天勺检验:介364.44月.000，“与对照组比较P<0.05;”与24h组比较，;c与48h组比较尸 <0.05

mTOR 10()bP图3一82大、不同时间点雷帕霉素对CvB3感染的心肌成纤维细胞mTOR表达的影响(RT-PcR)对照组;2:CvB3组;3:CVB3+R即组;dl、d2、d3分别表示干预后第I大、第第3大时间点。CvB3使心肌成纤维细胞mTOR表达增加，雷帕霉素抑制其表达。 3.4.2WestcmBlot检测心肌成纤维细胞mTOR蛋白表达用 10nM雷帕霉素干预CVB3感染的心肌成纤维细胞48h， WestemBlot检测发现各组均在289切处有阳性条带出现，mTO侧p一actin灰度值分别为0.2肚0.09、0.9肚0.13、0.1妊0.03、0.2肚0.05，CvB3组高于对照组，Rap组低于对照组、CVB3+Rap组低于CVB3组，差异均有显著性(F=166.695，尸<0.05)(见图3一9)。 1234一翻.
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R725.4

【参考文献】

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本文编号：2660248