重庆地区儿童人类偏肺病毒感染状况调查及融合蛋白的真核表达

发布时间：2020-05-29 05:02

【摘要】： PART I:重庆地区儿童偏肺病毒感染状况调查目的:检测重庆地区儿童人类偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)特异性IgG抗体,了解不同年龄儿童该病毒感染状况。方法:由于hMPV与儿童最常见的呼吸道病毒病原——呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus , RSV)同属副粘病毒科,需首先明确hMPV与RSV有否交叉抗原。采用RSV抗原吸附血清标本中可能存在的RSV抗体,用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)法比较未经吸附和已吸附RSV抗体的血清与RSV或hMPV感染细胞裂解液的反应情况;制备抗hMPV兔血清,用免疫印迹法检测该血清与hMPV和RSV反应性,进一步排除RSV和hMPV之间存在交叉抗原的可能性。然后用hMPV感染的Vero-E6细胞裂解液为抗原,用ELISA法检测325份0-6岁非呼吸道感染患儿和正常儿童的血清标本中hMPV IgG抗体。结果:经RSV抗原吸附的血清与RSV抗原反应性明显降低,同一血清与hMPV的反应性却无明显改变;免疫印迹法证实,用hMPV抗原免疫家兔获得的抗hMPV抗血清仅与hMPV抗原反应,而不与RSV抗原反应,提示RSV与hMPV间并无交叉抗原性。用ELISA法检测发现重庆地区0-6岁儿童hMPV抗体平均阳性率为78.8%。而不同年龄组儿童血清中hMPV IgG抗体阳性率分别为:0-5月组为74.5%,6-11月组为64%,12-23月、24-35月、3-6岁组分别为72.7%、90.3%、93.1%。在各年龄组中RSV与hMPV阳性率非常相近。结论:hMPV是重庆地区儿童常见的呼吸道病毒病原,既往感染率与RSV相似,至6岁时儿童几乎均经历过hMPV感染。 PART II:重庆地区儿童血清人类偏肺病毒中和活性初步研究目的:体液免疫中的重要组成部分中和抗体可以阻止病毒的吸附,在预防呼吸道疾病的发生和疾病的恢复中起重要作用。hMPV已被证实为我国儿童重要的呼吸道病毒病原之一,本研究拟初步分析重庆地区0-6岁儿童血清hMPV中和活性及与hMPV IgG抗体水平的关系,为进一步大样本的血清流行病学研究奠定基础。方法:0-35月龄儿童血清来自因外科疾患住院的儿童,3-6岁儿童血清来自托幼儿童体检血清,共50份血清标本。采用微量中和实验检测上述血清中hMPV中和活性,分析血清中和活性水平及其与hMPV IgG抗体水平的相关性。结果:在抽取的50份血清标本中,此前通过间接酶联免疫吸附试验检测为阴性的8份标本均未显示中和活性,而42份hMPV IgG抗体阳性血清标本中和活性均显示阳性,平均中和滴度为1:129。其中0-5月组中和滴度均值为1:160,6-11月、12-23月、24-35月、3-6岁组中和滴度均值分别为1:58.9、1:114.9、1:172.8、1:160。血清中抗hMPV IgG抗体水平和中和活性具有显著相关性,r=0.668,但hMPV IgG水平与中和活性并不平行。结论:0-6岁儿童血清中多具有hMPV中和活性,但其是否足以预防不同亚型hMPV感染尚待进一步研究。 PART III:人类偏肺病毒融合蛋白基因的克隆和真核表达目的:融合蛋白(fusion protein, F)是病毒表面结构蛋白,其可以刺激机体产生保护性抗体,故在致病机制中扮演重要的角色。因此我们选择构建hMPV F基因的真核表达质粒,并通过在昆虫细胞sf-9中表达从而获得具有正确空间结构及抗原性的重组F蛋白,为今后研发血清学诊断试剂、以及制备单克隆抗体与疫苗奠定基础。方法:采用RT-PCR法扩增人类偏肺病毒A亚型F基因的全长序列,将序列片段插入供体质粒pFastBacHT载体多克隆位点区,经酶切鉴定后转化大肠杆菌DH10Bac,供体质粒与受体杆粒(Bacmid)发生位点特异性转座获得重组的杆粒。采用脂质体将重组杆粒转染进昆虫细胞sf-9,包装获得感染性杆状病毒。用此病毒感染sf-9细胞并表达蛋白,经可结合6×His Tag的树脂纯化后用免疫印迹法验证表达蛋白。结果:PCR及序列分析证实所获得的重组杆粒包含hMPV全长F基因序列,被重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf-9显示典型细胞病变效应。采用抗6×His单克隆抗体为一抗,免疫印迹法检测到分子量约70KDa的较单一的蛋白条带,证实F蛋白表达成功。结论:杆状病毒是一高通量、目标蛋白抗原性保存完好的表达系统。采用这一系统成功表达的hMPV F蛋白,将为hMPV血清流行病学研究、免疫发病机理研究和疫苗研究奠定基础。
【图文】：

Vero-E6细胞

图 1-1 hMPV 感染 Vero-E6 细胞病变Figure 1-1 Cytopathic effects on Vero-E6 cells caused by hMPVA:mock Vero-E6 cells(×100)；B,C,:hMPV infected Vero-E6 cells with obvisous CPE(×100) D:hMPV infected Vero-E6 cells with obvisous CPE(×200)hMPV were inoculated onto Vero-E6 cells. CPE of focal changes, increased granulars, celldestruction and subsequent detachment appeared at days 5 post inoculation.3.2RT-PCR用 Trizol 试剂提取 Vero-E6 细胞总 RNA，经逆转录成 cDNA 后，，扩增 hMPV基因组中 F 基因片段，同时以未感染病毒的 Vero-E6 细胞组作为阴性对照。PCR产物凝胶电泳后显示目的条带，F 基因产物 450bp，阴性对照无条带（图 1-2）。

RT-PCR扩增,基因,稀释浓度,血清

1 2 3 4图 1-2 hMPV F 基因 RT-PCR 扩增ure 1-2 RT-PCR results against hMPol for F gene with RNA from mock infeF gene with RNA from hMPV infected marker血清稀释浓度的确定实验，可以看出在抗原包板浓度为度 OD 值大致在 1 左右，且与对照浓度 1：100，血清稀释浓度在 1：
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R725.1

【参考文献】