APHGAP18基因调控胎儿血红蛋白合成的功能研究

发布时间：2020-05-31 18:18

【摘要】：目的:ARHGAP18基因调节细胞形态、迁移和粘附,参与细胞增殖凋亡等过程,影响疾病发生发展。探讨ARHGAP18基因在胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)合成中的作用,为β地中海贫血的靶向治疗提供理论依据。方法:1.体外适宜条件下培养人类慢性髓系白血病细胞系K562细胞,实时荧光定量PCR聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)验证ARHGAP18基因在K562细胞表达丰度,以A549细胞作为对照。2.特异性siRNA设计,构建慢病毒载体并筛选敲减率最佳的慢病毒载体:根据Genebank中ARHGAP18基因mRNA序列,设计合成3条针对ARHGAP18基因编码区的siRNA靶序列,随机设计无关对照序列作为阴性对照。构建3种带有绿色荧光蛋白筛选标记的ARHGAP18基因特异性shRNA重组慢病毒:shARHGAP18-KD1、shARHGAP18-KD2、sh ARHGAP18-KD3及阴性对照重组病毒shCtrl。将3种携带sh ARHGAP18病毒和shCtr1病毒分别转染K562细胞株,荧光显微镜下观察转染效率。RT-PCR分别检测ARHGAP18基因转录水平,筛选靶点敲减效率最佳的一种重组慢病毒。最佳干扰序列和阴性对照序列进入后续实验。3.设置重组慢病毒shARHGAP18-KD组、阴性对照shCtrl组和空白对照CON组,转染K562细胞。分别通过CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测敲减ARHGAP18基因后不同时间点K562细胞增殖和凋亡情况。探讨体外特异性沉默ARHGAP18基因对K562细胞的生物学特性的影响。4.RT-PCR验证敲减ARHGAP18基因后γ珠蛋白基因HBG1和HBG2mRNA表达变化,探讨ARHGAP18基因在HbF合成中的作用。HBG1/2基因编码γ珠蛋白链,两条γ珠蛋白链与两条α珠蛋白链构成HbF。结果:1.K562细胞中ARHGAP18 mRNA表达水平是对照的7.41倍(P0.01)。2.荧光显微镜下重组慢病毒感染K562细胞感染效率80%。RT-PCR显示K562细胞中,shARHGAP18-KD1组较shCtrl组ARHGAP18基因敲减率7.2%(P0.05);相比于shCtrl组,shARHGAP18-KD2组基因敲减率69.0%(P0.05);shARHGAP18-KD3组基因敲减率65.4%(P0.05)。sh ARHGAP18-KD2组是最佳干扰序列组。3.CCK-8试验结果是空白组、阴性对照组和shARHGAP18-KD2组K562细胞在感染后5天细胞增殖无明显差异。FCM结果显示三组细胞凋亡率存在差异,(shCtrl组:4.80±0.25%,CON组:2.91±0.18%,shARHGAP18-KD2组:3.74±0.12%,CON对比shCtrl P=4.60×10~(-4),shCtrl对比sh ARHGAP18-KD2 P=2.80×10~(-3),CON对比sh ARHGAP18-KD2 P=2.80×10~(-3)),但凋亡率差异小于20%。4.RT-PCR的结果显示,与shCtrl组相比,转染shARHGAP18-KD2的细胞中HBG1基因表达增加了2.2倍(P=3.91×10~(-2)),HBG2基因表达增加了1.6倍(P=1.60×10~(-3))。结论:1.ARHGAP18基因在K562细胞中高表达。2.shARHGAP18-KD2在K562细胞中具有良好的靶向效率。建立了ARHGAP18基因相对低表达的K562细胞株。在K562细胞中敲减ARHGAP18基因,促进细胞凋亡,差异具有统计学意义,但对细胞增殖影响不显著。3.ARHGAP18基因与HbF相关,敲减ARHGAP18基因,HBG1、HBG2表达增多,ARHGAP18基因有望成为β地中海贫血的治疗靶标。
【图文】：

最佳干扰序列（shARHGAP18-KD2）和阴性对照序列（shCtrl）进入后续实验。表3-1 RT-PCR检测ARHGAP18 mRNA的表达（平均数±标准差）分组 ARHGAP18 mRNA表达量 敲减效率（%）NC 1.00±0.00 0.00KD1 0.93±0.11 7.20KD2 0.31±0.06 69.00KD3 0.35±0.08 65.40图 3-2：慢病毒载体转染 K562 细胞敲减 ARHGAP18（A）慢病毒感染细胞的效率，，放大倍率 x200（B）ARHGAP18 mRNA 表达

AP18-KD2组（KD组）、空白对照组（CON组）和阴性对照组（标仪对波长450nm的光的吸收率随时间变化的对比，OD450反的细胞的数量。CON组对比NC组P=7.96×10-8, NC组对比K0-7, CON组对比KD组P=1.38×10-9。每个数据点代表吸光度值准差（表格3-1，图3-3）。表格3-2 3组细胞1~5天CCK8 OD450值（平均数±标准差）Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 50.24±0.00 0.46±0.01 0.854±0.02 1.643±0.07 3.26±00.28±0.01 0.57±0.03 1.065±0.04 1.838±0.06 3.31±00.30±0.01 0.63±0.01 1.048±0.05 1.709±0.04 3.00±08检测结果表明：相比NC组，KD组细胞增殖无明显变化。18基因对K562细胞增殖影响不明显。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.5

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本文编号：2690266