NMDA受体激活对肺泡巨噬细胞分泌作用的影响及机制研究

发布时间：2020-06-01 12:03

【摘要】： 第一章巨噬细胞NMDA受体表达及其高氧暴露的影响目的:N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体是谷氨酸受体的重要亚型,NMDA受体(NMDAR)过度激活引起的兴奋性神经毒性是引起神经细胞损伤的最后共同通路,在多种急慢性脑损伤的发生发展中发挥重要作用。在外周非神经组织对NMDA受体的研究较少,近年来发现NMDA受体在肺脏也有较高水平的表达,但生物学意义尚不清楚。高氧性肺损伤是新生儿救治过程中的常见并发症,严重影响新生儿的生存质量,但其发病机制尚未完全阐明。Said等首先报道NMDA可引起离体灌流肺发生高通透性肺水肿,他们进一步研究发现,在成年大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)存在NMDA受体亚型NMDAR1及NMDAR2D的表达。本室前期研究发现,持续高氧暴露可致新生大鼠肺组织谷氨酸大量释放、NMDA受体表达增强。申丽等近期研究表明,在整体水平上NMDA受体的激活具有肺毒性效应。但NMDA受体在新生大鼠和RAW264.7细胞的表达情况以及持续高氧暴露是否会引起NMDA受体表达变化还未有直接的证据。因此,本研究的目的是观察NMDA受体各亚型在成年大鼠肺泡巨噬细胞、新生大鼠肺泡巨噬细胞和RAW264.7细胞的表达以及高氧暴露条件下新生大鼠肺泡巨噬细胞NMDA受体的表达变化。方法: 1.支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL)分离、培养成年及新生大鼠肺泡巨噬细胞。 2.免疫细胞化学技术观察在成年大鼠AM、空气暴露新生大鼠AM、高氧暴露新生大鼠AM及RAW264.7细胞上NMDAR1蛋白的表达。 3.RT-PCR法检测成年大鼠AM、空气暴露新生大鼠AM、高氧暴露新生大鼠AM及RAW264.7细胞NMDAR1 mRNA的表达。 4.Real-time PCR法检测成年大鼠AM、空气暴露新生大鼠AM、高氧暴露新生大鼠AM及RAW264.7细胞NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D的mRNA表达。结果: 1.免疫细胞化学观察到NMDAR1在4组细胞均有表达,新生大鼠AM中NMDAR1的表达明显高于成年大鼠,持续高氧暴露后新生大鼠AM中NMDAR1的表达进一步增强,RAW264.7细胞NMDAR1的表达和成年AM无明显差异。 2.RT-PCR法检测到新生大鼠AM NMDAR1mRNA的表达明显高于成年大鼠AM,持续高氧暴露后新生大鼠AM中NMDAR1mRNA的表达进一步增强,RAW264.7细胞NMDAR1mRNA的表达与成年大鼠AM无明显差异。 3.Real-time PCR法检测到NMDAR各亚型mRNA在4组细胞均有表达,以NMDAR2D表达最强,NMDAR1次之,NMDAR2C、NMDA2B和NMDA2A表达水平较低。新生大鼠AM NMDAR各亚型mRNA比成年大鼠AM有较高表达,高氧暴露后新生大鼠AM NMDAR各亚型mRNA的表达进一步增强。结论: 1.在成年大鼠AM、新生大鼠AM及RAW264.7细胞上除有NMDAR1及NMDAR2D亚型的表达外,还存在NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C亚型的表达。 2.肺泡巨噬细胞NMDA受体呈年龄依赖性表达。 3.持续高氧暴露可以上调肺泡巨噬细胞NMDA受体各亚型的表达,提示肺泡巨噬细胞是NMDA受体参与高氧性肺损伤的重要靶细胞。第二章NMDA受体激活对肺泡巨噬细胞一氧化氮产生及分泌的影响目的:研究表明一氧化氮(nitric oxide,NO)在兴奋性神经毒性所致的中枢神经系统损伤中起着关键的作用。Said等发现NMDA受体拮抗剂MK-801和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂(L-NAME)可以减轻NMDA引起的离体肺高通透性肺水肿,表明NMDA在肺脏的损伤作用同样也是NO依赖性的。本研究的目的在于观察NMDA受体激活对离体培养的肺泡巨噬细胞NO的产生及分泌有何影响,进一步证明肺泡巨噬细胞通过NMDA受体的激活促进NO的产生和分泌,而参与高氧性肺损伤的发生发展过程。方法: 1.用生化试剂盒测定不同浓度、不同时间NMDA干预对肺泡巨噬细胞产生及分泌NO的影响。 2.根据NO与NMDA的量效与时效关系,选择适宜的NMDA干预条件对肺泡巨噬细胞进行干预后,对细胞的活力、细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性及细胞提取物中丙二醛(MDA)含量进行测定。 3.用生化试剂盒检测NMDA对肺泡巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影响。 4.Real-time PCR法检测NMDA对肺泡巨噬细胞iNOSmRNA的影响。结果: 1.肺泡巨噬细胞分泌NO的量与NMDA有一定的剂量依赖性关系,随着NMDA浓度的增加NO的量逐渐增多,NMDA 1μmol/L时NO的量达顶峰,NMDA 10μmol/L时NO的量较前明显下降;肺泡巨噬细胞分泌NO的量与NMDA干预的时间有关,NMDA1μmol/L干预6h时NO的量达顶峰,干预8h时NO的量较前明显下降。 2.1μmol/L NMDA干预肺泡巨噬细胞6h对细胞活力、LDH活性、MDA含量无明显影响,表明此干预条件未对细胞造成损伤。 3.NMDA(1μmol/L)与肺泡巨噬细胞共培养6h,细胞iNOSmRNA表达及活性、细胞培养上清液中NO含量均较对照组明显增高,MK-801(10μmol/L)预处理细胞30min后再给予NMDA干预,iNOSmRNA表达及活性、NO含量均较NMDA组明显下降。结论:NMDA受体激活可以增加肺泡巨噬细胞iNOS的转录,提高iNOS的活性,促进肺泡巨噬细胞NO的产生和分泌,表明肺泡巨噬细胞可能是肺损伤时NO增多的重要细胞来源。第三章NMDA受体激活对肺泡巨噬细胞分泌促炎性细胞因子的影响目的:本研究小组前期结果表明高氧性肺损伤时新生大鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA的表达及分泌明显增加,MK-801可以抑制上述效应,表明在整体水平上,NMDA受体激活参与介导了高氧性肺损伤时肺内促炎性细胞因子分泌增多的过程。本研究目的在于观察NMDA对体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2的影响,论证NMDA受体的激活可以促进肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子的产生和分泌及肺泡巨噬细胞是高氧性肺损伤时促炎性细胞因子产生的重要来源的假说。方法: 1.ELISA法测定细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2含量。 2.Real-time PCR法检测肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA表达。结果:NMDA可以上调肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA表达及分泌,MK-801可以抑制上述效应。结论:NMDA受体的激活能够上调肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2的表达并促进其分泌,表明肺泡巨噬细胞是高氧性肺损伤时促炎性细胞因子分泌增多的重要来源。第四章NMDA受体激活促进肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子产生和分泌机制的初步研究目的:前文发现,NMDA可促进肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子的转录和分泌,但NMDA是通过何种信号转导途径影响促炎性细胞因子转录尚不清楚。在高氧性肺损伤的炎性反应过程中,NF-κB参与了肺泡巨噬细胞的活化,并控制着多种促炎性细胞因子的基因表达。细胞因子、NO等相互激发、相互影响在高氧性肺损伤过程中起着重要的作用。本研究将进一步探讨NO、NF-κB在NMDA促进肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子产生和分泌中的作用,以论证NF-κB是NMDA受体激活影响肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子产生和分泌的重要信号转导途径的假说。方法: 1.化学法测定细胞培养液中NO含量和细胞提取物iNOS活性,ELISA法、Real-time PCR法分别检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2含量及TNF-α、IL-1β、IL-6、MIP-2及iNOSmRNA表达,反映NO、NF-κB在NMDA促肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子分泌中的作用。 2.Western Blot法测定NF-κBp65、I-κBα蛋白水平的变化,反映肺泡巨噬细胞NF-κB的激活。 3.凝胶滞留实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)测定肺泡巨噬细胞NF-κB与DNA的结合活性。结果: 1.AG(iNOS选择性抑制剂,100μmol/L)可以抑制NMDA诱导的肺泡巨噬细胞iNOS活性、NO含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA及分泌的增加,但对iNOSmRNA表达无明显影响。 2.SN50(NFκB转录因子的核转位抑制剂,15μmol/L)可以抑制NMDA诱导的肺泡巨噬细胞iNOSmRNA表达及活性、NO含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2 mRNA及分泌的增加。 3.Western Blot实验显示NMDA可以通过促进肺泡巨噬细胞I-κBα的降解而激活NF-κB,MK-801、AG、SN50可以抑制NMDA诱导的I-κBα的降解及NF-κB的激活。 4.EMSA实验显示NMDA可以增强NF-κB的DNA结合活力,MK-801、AG、SN50可以抑制NMDA诱导的NF-κB DNA结合活力的增加。结论:NF-κB是NMDA受体激活促进肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子分泌过程中的重要转录调控因子,NO可能通过促进NF-κB的激活而增加促炎性细胞因子的分泌。
【图文】：

扩增曲线,管家基因,浓度,梯度稀释

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 }}}}}}}}}{{{{{… … … {}{{{{{{{、、 }}}}}}}}}{}1111111}{川川川川图IR七 altimePCR扩增曲线图2标准曲线1.2.6.6结果分析各样本的目的基因和管家基因(Actin)分别进行 RealtimePCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以管家基因的浓度，即为此样品该基因的校正后相对表达水平。 1.2.7统计学分析实验数据以均数士标准差(x士s)表示，运用SPSS统计软件对结果进行分析，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one， ayANOvA)比较各组差异性。检验水准 a=0.05

曲线,曲线,标准曲线,R反应

.2.6.5荧光定t阳R反应体系的配制:(总体积50卜l)ZXPCRbuffer25plPrimers(25pmol/pl)0.6p1xZ模板(cDNA)1plDEPC水22.8”1Total50pl荧光定量PCR扩增条件的设置:94oC4min，94oC155，60oC25s，72oC25s，循环40次定量PCR扩增曲线和标准曲线扩增曲线显示各标准品每梯度之间相差2一3CT值，S形曲线形态较好。标准曲线显示各梯度分布在同一直线上，其相关系数为0.99以上，认为可信。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R722.1

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