Connexin43基因与先天性心脏病发病机制的研究

发布时间：2020-06-01 22:17

【摘要】： 先天性心脏病(简称先心病)是人类最常见的出生缺陷之一，其发病机理的研究已经成为热点课题，研究者试图找出其发病的原因并加以预防，减少发病率，以提高出生人口的质量。遗传因素日渐受到重视，某些控制心脏发育基因的突变或功能缺陷可能是先心病的分子基础。其中，连接蛋白43(Connexin43，Cx43)基因作为先心病的重要候选基因之一正被日益关注。Cx43是哺乳动物心脏中最主要的连接蛋白，其在细胞膜上聚合而成的缝隙连接通道是介导相邻细胞间离子、小分子代谢物和信号分子跨膜交流的重要结构基础。近年来一系列动物模型的研究提示Cx43在心脏形态发育中具有重要作用，Cx43基因缺陷或过量表达均可导致以右室流出道肥厚梗阻为主的心脏畸形。但目前关于人类先心病与Cx43基因异常之间关系的研究还非常有限，Cx43基因在先心病发病中所起的作用迄今还未有明确的结论。本研究通过Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠，观察其胚胎期的心脏发育及其可能的病理机制。同时，对汉族先心病患者进行一个大样本的Cx43基因突变检测的研究，较全面地观察Cx43基因突变是否与先心病发病相关，并检测先心病患者心肌Cx43基因的表达，为阐述先心病的病理机制提供有价值的资料。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心脏表型及相关基因的表达 研究目的 观察Cx43基因敲除(Cx43KO)小鼠心脏异常发育的表型及其胚胎期心脏中Cx40和Cx45的时空表达规律，探讨其发生心脏畸形的可能机制。 材料和方法 2月龄Cx43KO杂合小鼠交配，选用其后代胚胎期(embryonic day，ED)13.5天至出生后1天小鼠作为研究对象，采用PCR方法鉴定基因型。根据基因型分为Cx43KO纯合子(Cx43-／-)、杂合子(Cx43+／-)及野生型(Cx43+／+)；C57BL6小鼠作为对照组。小鼠进行显微解剖观察心脏大体结构，心脏组织切片，HE染色观察心脏形态学结构。同时选取ED10.5～15.5的Cx43KO纯合子及野生型小鼠胚胎，免疫组化ABC法检测Cx40、Cx45在心脏的时空表达，SCIM显微图像分析系统对染色强度进行定量分析。 结果 1．Cx43KO新生小鼠在解剖显微镜下观察发现：纯合型Cx43KO小鼠心脏主要表现为肺动脉近右室流出道端明显膨隆突出；而野生型、杂合型和C57BL6小鼠心脏大体结构未见异常。 2．心脏切片HE染色显示：胚胎期及新生纯合型Cx43KO小鼠心脏主要表现为右室流出道明显梗阻；野生型、杂合型和C57BL6小鼠心脏形态学结构未见异常。 3．野生型小鼠胚胎心脏Cx40从ED11.5开始在右室表达，随后逐渐分布于各房室，ED14.5后在心室的表达开始减弱，出生后主要分布于心房、希氏束及浦氏纤维；Cx45在ED10.5表达于心脏流入道、流出道心肌及房室垫，但随后表达开始下调，仅在流出道继续表达，成年后主要在室间隔部分表达。Cx43KO小鼠Cx40和Cx45的时空表达在ED10.5～15.5这一心脏分隔、瓣膜发育的关键时期却较野生型明显减弱(P＜0.05)。 结论 1．Cx43KO小鼠存在明显的心脏发育异常，主要表现为右室流出道梗阻。 2．Cx43KO小鼠心脏发育过程中Cx40和Cx45时空表达出现异常，这可能是其发生心脏畸形的相关的潜在机制。 第二部分Cx43基因在先天性心脏病中的突变检测 研究目的 检测先心病患者中Cx43基因的突变，观察Cx43基因突变与人类先心病的关系，为阐述先心病的病因提供有价值的资料。 材料和方法 研究对象包括试验组250例不同类型的先心病患者，40例健康儿童为对照组。试验组分成复杂先心病和简单先心病两个亚组：复杂先心病182例，主要以心脏圆锥动脉干畸形为主；68例简单先心病包括室间隔缺损(VSD)、房间隔缺损(ASD)、动脉导管未闭(PDA)和肺动脉狭窄(PS)。基因组DNA全部从外周血提取，同时亦从心脏手术中收集部分先心病患者的右室流出道心肌中提取DNA，与外周血相对照。在Cx43编码序列两侧设计一对引物(F1和R3)，扩增片段长度为1348bp。其中上游引物设计在内含子中，以避免基因组中Cx43假基因的非特异扩增。同时在编码区内设计4条引物(R1、F2、R2和F3)，并与2条外侧引物一起配成3对作为测序引物。PCR产物纯化后进行DNA直接测序。 结果 1．所有标本均成功由PCR扩增出Cx43基因的全长编码序列，PCR产物的长度为1348bp，与所设计的片段大小预期值符合，特异性理想。 2．所有研究对象的Cx43基因测序后同GenBank人类Cx43编码序列进行比较，仅有1例患者(法洛四联症)存在1个单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，为924位核苷酸G→A。其余研究对象的测序结果均未发现Cx43基因突变。 结论 1．人类先心病中Cx43基因编码区可能不存在规律性的基因位点突变。 2．Cx43基因外显子的突变在先心病中可能很少见，进一步说明人类心脏的发育是一个涉及多基因、多环节、多因子的精细复杂的过程，Cx43基因参与人类先心病的发病需要更深入的研究。 第三部分Cx43基因在法洛四联症心肌中表达的研究 研究目的 检测法洛四联症(tetralogy of Fallot，TOF)患者心肌Cx43基因的表达。为解释Cx43基因与某些先心病的关系提供证据。 材料和方法 试验组为16例TOF的右室流出道心肌，4例单纯VSD和1例原发性肺动脉高压患者的右室流出道心肌为对照，通过RT-PCR的方法检测Cx43 mRNA的表达差异，SCIM显微图像分析系统对灰度值进行半定量分析。进一步对心肌切片行免疫组化ABC法，观察心肌细胞中Cx43蛋白的表达。 结果 1．与对照相比，TOF患者Cx43基因表达水平明显增高。从Cx43／β-actin的比值可见，TOF患者Cx43基因mRNA水平显著高于对照(P＜0.01)。 2．免疫组化提示TOF右室心肌细胞具有较高的Cx43表达，而对照心肌则未见明显的Cx43表达。 结论 1．TOF右室流出道心肌Cx43的高表达提示胚胎期心脏发育过程中可能存在Cx43时空表达紊乱。 2．Cx43基因转录表达的异常可能影响相关心脏发育因子的调控作用，从而导致参与心脏发育基因表达紊乱，这可能是TOF发病的一种潜在机制。 3．TOF作为人类最常见的先天性圆锥动脉干畸形，其心肌Cx43基因的异常表达为探讨Cx43基因功能缺陷导致先心病提供了新的线索。 总结 Cx43KO小鼠存在心脏畸形和Cx40、Cx45基因表达异常，表明Cx43基因与心脏发育密切相关，提示其在心脏发育过程中存在精细的调节机制。就人类而言，大多数先心病患者中可能不存在规律性的Cx43基因突变，提示Cx43基因突变引起先心病并不多见，Cx43基因可能是心脏发育中的重要环节之一；TOF心肌Cx43基因的异常表达提示其功能缺陷对先心病发病所起的作用。人类心脏的发育是一个多基因、多信号和多环节参与的复杂过程，Cx43基因异常可能导致这一过程出现紊乱，同时引起相关心脏发育因子的异常，从而导致先心病的发生。因此揭示Cx43与其它相关基因在心脏发育中相互作用及调控机制需要更深入的研究。
【图文】：

存在显著的右室流出道圆锥部异常膨隆，多形成左右2个突起部分;右心室肥厚，左心室有时可见不同程度缩小;多有左、右心房扩张;而野生型、杂合型和C57BL6新生小鼠心脏大体结构未见异常(图1一3)。图1一3新生小鼠心脏大体解剖图A:C57BL6/SJ新生小鼠心脏;B:Cx43一八新生小鼠心脏，见显著的右室流出道圆锥部异常膨隆(箭头处)，右心室肥厚，左心室可见轻度后移，左、右心房明显扩张;注:RV右心室;LV左心室;P肺动脉;RA右心房;LA左心房。

图1一5新生小鼠心脏切片HE染色A:Cx43一小鼠心脏的矢状切面，，示右室流出道有明显的肌性梗阻;C:对照组，右室流出道通畅;B:Cx43一小鼠心脏的冠状切面，示室间隔异常肥厚;D:对照组，心脏各腔室大小正常。注:PA肺动脉;AO主动脉;RV右心室;1刃左心室;IVS室间隔RVOT右室流出道;RVOTO右室流出道梗阻。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R725.4

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本文编号：2692151