环境内分泌干扰物引致儿童性早熟的机理及其中药治疗研究

发布时间：2020-06-06 02:47

【摘要】： 目的：探讨环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)与性早熟发病的关系，，制定针对EEDs拟雌激素作用的以中药为主的治疗方案，并深入研究中药治疗的作用机理。 方法：(1)运用反相高效液相色谱法检测73例性早熟患儿及年龄、性别匹配的38例正常儿童血清中数种有代表性的EEDs(包括：洗涤剂降解产物中的4-壬基酚(4-nonylphenol，4-NP)、有机氯农药DDT的代谢产物中的二氯二苯二氯乙烯(1，1-dichloro-2，2，bis(p-chlorophenyl)ethylene，p，p’-DDE)、塑料添加剂中的邻苯二甲酸-2-乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)的含量；同时测定性早熟患儿的靶器官发育指标，包括子宫、卵巢体积，骨密度及血清雌二醇E_2水平。对两组儿童的EEDs血清含量进行分析，并将血清EEDs含量与靶器官发育指标进行相关性分析及多元线性回归分析。(2)以21d雌性SD大鼠为实验对象，选取4-NP、双酚A(bisphenol A，BPA)、DEHP为染毒物质，均设高中低剂量，并将4-NP和BPA以低剂量混合喂饲连续三天，于末次给药后24h处死。以子宫湿重、脏器系数、子宫内膜及平滑肌增生程度和细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的蛋白表达作为检测指标，采用单因素方差分析方法进行统计。(3)制定针对EEDs拟雌激素作用的中药治疗方案，治疗受EEDs暴露的性早熟患儿及染毒动物，以上述生殖器官及骨骼发育水平作为检测指标；并采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time FQ-PCR)及免疫组织化学方法(immunohistochemistry，IHC)检测靶器官雌激素受体α(estrogen receptor alpha，ERα)、雌激素受体β(estrogen receptor beta，ERβ)、表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like factor-1 receptor，IGF-1R)的基因和蛋白的表达情况，采用单因素方差分析及t检验进行统计分析。 结果：(1)每一例正常儿童血清中均检测到一定含量的p，p’-DDE(14.93～40.39ng/ml)，部分正常儿童血清中检测到一定含量的4-NP及DEHP(ND～6.77ng/ml，ND～17.61ng/ml)。性早熟患儿血清中4-NP含量(ND～16.68ng/ml)、p，p’-DDE含量(40.03～91.68ng/ml)及DEHP含量(ND～64.71ng/ml)显著高于正常儿童(P＜0.01)。性早熟患儿血清中4-NP与子宫体积、卵巢体积、骨密度均呈显著正相关(r=0.394，0.286，0.237；P＜0.01)；p，p’-DDE与子宫体积呈显著正相关(r=0.306；P＜0.01)。4-NP对子宫体积的作用强度明显高于p，p’-DDE。(2)染毒动物实验结果显示，高中剂量的4-NP(200mg/kg，100mg/kg)和BPA(600mg/kg，400mg/kg)能够使染毒动物的子宫湿重及脏器系数明显增加(P＜0.01)，并且具有一定的剂量-效应关系；4-NP和BPA高中低三种剂量都能够使子宫内膜上皮增高，平滑肌增厚，PCNA蛋白表达增强(P＜0.05)。低剂量的4-NP(50mg/kg)和BPA(200mg/kg)混合喂饲后上述指标均较单独喂饲组显著增加(P＜0.01)。(3)第一部分筛查出的EEDs暴露水平增高的性早熟患儿经中药治疗三个月后，子宫体积、血清E_2含量、骨矿含量、骨密度、血清骨钙素含量较治疗前明显减小或降低(P＜0.01)。4-NP和BPA染毒的实验动物经中药治疗后，所有治疗组的子宫湿重、脏器系数、骨密度、子宫内膜上皮高度、子宫平滑肌厚度及PCNA蛋白表达均比实验组明显降低(P＜0.05)。中药治疗方案能够显著下调ERα及ERβmRNA在子宫、乳腺和骨骺端的表达水平(P＜0.05)，降低ERα及ERβ在子宫内膜上皮细胞、乳腺导管上皮细胞和骨骺端生长板软骨细胞的蛋白表达水平(P＜0.05)；能够显著下调EGFR mRNA在子宫、乳腺的表达水平(P＜0.05)，降低EGFR在子宫内膜上皮细胞、乳腺导管上皮细胞的蛋白表达水平(P＜0.05)；能够显著下调IGF-1R mRNA在干骺端的表达水平(P＜0.05)，降低IGF-1R在骨骺端生长板软骨细胞的蛋白表达水平(P＜0.05)。 结论：(1)当前正常儿童已经较普遍地暴露于环境内分泌干扰物，只不过暴露程度比性早熟患儿略轻而已；EEDs暴露与儿童性早熟的发病有密切关系，是其重要的致病因素之一；不同种类的EEDs对靶器官的致病作用强度有所不同。(2)动物染毒实验进一步证实了EEDs的拟雌激素作用及其剂量-效应关系；进一步验证了临床研究结果及其推论，证实EEDs的暴露程度与性早熟发病有密切关系；不同种类EEDs之间可以发挥联合增效作用，暴露人群更易受到不良影响；为子宫营养试验提供了更为敏感的检测指标。(3)制定了针对EEDs拟雌激素作用的中药治疗方案；研究结果表明所用中药能够有效拮抗EEDs的雌激素样活性，明显减轻EEDs对机体性发育及骨骼发育造成的不良影响；能够显著下调靶细胞雌激素受体的表达水平，降低机体对EEDs作用的敏感性；能够显著下调靶细胞生长因子受体的表达水平，干扰交叉对话机制，进一步加强其对EEDs拟雌激素活性的拮抗作用。
【图文】：

图卜l4一NP、p，p‘一oDE、OEHp高效液相色谱图1.5.3定量分析:样品处理后进行色谱分析，所得的峰面积与样品的工作曲线相比较，通过计算分别得出样品中4一NP、p一P’DDE、DEHP的实际浓度。1.6标准曲线和工作曲线1.6.1标准品的标准曲线及检测限:配制2、10、50、100、500、1000ng/ml6个浓度的标准品，做浓度一峰面积标准曲线。4一NP标准曲线:Y=26.62+854.39x，r=0.9988;p，p，一DDE标准曲线:Y二一1.18+693.83X，r=0.9999;DEHP标准曲线:Y=一0.02+230.00X，r=0.9999。在本实验条件下，ODS一3柱对4一NP、p一P’DDE、DEHP的检测下限均为ing/ml，信噪比为2。1.6.2工作曲线:以血清为空白，分别加入不同浓度的标准品，测得的峰面积减去空白值(该份血清的测定值)，绘制浓度一峰面积工作曲线。4一NP工作曲线为Y二30.49十655.12X，

(ng/ml)图1一3性早熟组和正常对照组4一P、P，p，一DDE、DEHP血清含量分布情况由表1一3及图1一3可以看出，性早熟患儿血清中4一NP、P，pr一DDE和DEHP的含量均显著高于正常对照组(尸<0.01)。性早熟组患儿4一NP、P，p’一DDE和DEHP的血清含量大多在4ng/ml、song/ml、20ng/ml以上。3讨论环境内分泌干扰物(EEDs)是指环境中存在的能够干扰机体内分泌系统诸环节并导致异常效应的物质。近年来国外有大量文献报告，由洗涤剂、农药及塑料等制造业向自然界中排放的物质及其分解产物含有一系列的EEDS〔’·4、37〕。早在1995年，美国环境与自然资源委员会就把EEDs的研究列为其五个最优先研究项目之一。EEDs所引起的一系列危害也逐渐引起中国政府重视。这些物质具有一些共同的生物学特点，例如在环境中化学性质稳定，不易被生物降解;大多脂溶性强易被机体吸收，并可通过食物链在生态系统内进行生物富集而蓄积。EEDS可经某些途径包括污染的水源、食物或经皮肤
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R725.8;R272

【引证文献】

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本文编号：2699031