HIF-1α抑制PTEN转录参与调节BMSCs对海马神经元OGD损伤后的保护作用

发布时间：2020-06-15 04:35

【摘要】：背景:新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic induced brain damage,HIBD)是多种因素引起的胎儿或新生儿脑缺氧和/或缺血所致的疾病,干细胞在其治疗中成为研究热点。课题组前期实验在CoCl_2预处理模拟缺氧条件下发现缺氧诱导因子HIF-1α参与间充质干细胞对HIBD大鼠的认知修复过程及神经元突触可塑性调节;研究发现PTEN也广泛参与缺血性脑损伤的病理生理过程及AMPA受体的突触调节,但具体机制尚不清楚。目的:探讨BMSCs旁分泌对海马神经元OGD损伤后的保护作用及与HIF-1α和PTEN两者间关系。方法:1.采用双层培养皿嵌套分离共培养,BMSCs与海马神经元无直接接触,但其分泌因子能发挥作用。实验分为((1)常氧培养组(Control)、(2)氧糖剥夺组(Oxygen-glucose deprivation,OGD)、(3)氧糖剥夺分离共培养组(OGD+OGD-BMSCs)、(4)氧糖剥夺海马神经元与HIF-1α激动剂CoCl_2预处理的BMSCs分离共培养组(OGD+CoCl_2-BMSCs)、(5)氧糖剥夺海马神经元与HIF-1α激动剂CoCl_2及HIF-1α抑制剂2ME-2预处理的BMSCs分离共培养组(OGD+2ME-2-CoCl_2-BMSCs)、(6)PTEN抑制剂bpV预处理氧糖剥夺海马神经元组(OGD+bpV)。2.24小时后行LDH及AnnexinV-FITC/PI实验检测神经元细胞损伤、细胞凋亡水平以研究BMSCs对海马神经元OGD损伤后的保护效应及HIF-1α、PTEN在此过程中的作用;3.提取BMSCs与海马神经元蛋白,行Western blot实验明确各组中HIF-1α蛋白、PTEN蛋白及p-PTEN蛋白表达水平变化;4.ELISA检测BMSCs各组中VEGF蛋白水平以论证BMSCs的旁分泌效应;5.免疫共沉淀及ChIP-qPCR探讨BMSCs及海马神经元中HIF-1α和PTEN间相互作用关系。结果:(1)LDH及AnnexinV-FITC/PI检测结果显示:与BMSCs分离共培养的海马神经元细胞损伤程度(P0.01)及细胞凋亡水平(P0.001)在氧糖剥夺后明显下降;而HIF-1α抑制剂2ME-2预处理后海马神经元损伤程度及凋亡水平增高(P0.001);PTEN抑制剂bpV预处理氧糖剥夺海马神经元后LDH水平(P0.01)及细胞凋亡(P0.001)水平下降;(2)Western blot结果显示:在氧糖剥夺后,BMSCs及海马神经元中HIF-1α蛋白水平(P0.01)及PTEN蛋白水平(P0.05)均增高,p-PTEN蛋白表达下降(P0.01);HIF-1α抑制剂2ME-2预处理BMSCs后PTEN蛋白水平(P0.05)增高,p-PTEN蛋白表达下降(P0.05);与BMSCs分离共培养的海马神经元HIF-1α蛋白水平(P0.01)及PTEN蛋白水平(P0.001)下降,而HIF-1α抑制剂2ME-2预处理后PTEN蛋白水平(P0.05)增高,PTEN抑制剂bpV预处理氧糖剥夺海马神经元后p-PTEN蛋白表达增高(P0.05);(3)采用ELISA探讨BMSCs培养基中生长因子的分泌情况,氧糖剥夺后VEGF水平升高(P0.001),加入HIF-1α抑制剂后水平下降(P0.001),且CoCl_2组水平较OGD组VEGF水平无统计学差异;(4)ChIP-qPCR结果提示BMSCs及海马神经元中HIF-1α蛋白可进入细胞核内并富集于PTEN基因启动子区域,且OGD组富集倍数较Control组显著升高(P0.001);(5)免疫共沉淀结果显示BMSCs及海马神经元各组中HIF-1α和PTEN在蛋白质水平无直接结合。结论:(1)缺氧条件下BMSCs可通过其旁分泌效应保护受损神经元,降低神经元细胞损伤及凋亡水平;(2)HIF-1α激活、PTEN被抑制参与BMSCs对神经元OGD损伤后的保护作用且HIF-1α被抑制时PTEN蛋白表达增高;(3)BMSCs及海马神经元中HIF-1α蛋白可进入细胞核内并富集在PTEN基因启动子区域负性调节其转录过程。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R722.1
【图文】：

技术路线图,技术路线

技术路线Fig.1Technicalroute

海马神经元,细胞形态,光镜,损伤后

图 1 光镜下观察 BMSCs 与海马神经元 OGD 损伤前后细胞形态（20×）Fig.1 Observation of cell morphology of BMSCs and hippocampal neurons before and afterOGD injury under light microscopic(20×)3.2 25uM bpV 为海马神经元 OGD 损伤后培养 24h 条件下抑制 PTEN

【参考文献】