NOX4和eNOS在小鼠慢性缺氧肺血管中的表达和相互关系

发布时间：2020-06-19 11:58

【摘要】： 【目的】新生儿持续性肺动脉高压(PPHN)是新生儿危童症之一,以肺血管阻力增加引起肺动脉压持续升高为特征,伴有动脉导管和(或)卵园孔的右向左分流,常引起严重的低氧血症而危及生命。缺氧是PPHN发生和病情恶化的重要危险因素之一。缺氧引起的肺血管收缩和肺血管重建是肺动脉高压的主要病理基础,后者主要表现为肺小动脉中层肥厚,平滑肌细胞肥大、增生及非肌型小血管肌化。 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶,简称NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)是血管内生成活性氧簇((reactive oxygen species,ROS)的主要酶体。近年来非吞噬细胞NOX的研究受到重视。在不同种类细胞中发现一系列NOX催化亚单位即NOX主要功能亚单位gp91phox的同源物,后来被命名为NOX蛋白家族分别称其为NOX1、NOX2(即gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5以及双功能氧化酶Duox1和Duox2。为非吞噬细胞ROS的产生和功能提供了直接证据。非吞噬细胞NOX在很多的病理和生理过程中起重要的作用,包括参与基因的表达和蛋白合成的转录后调节、细胞的信号传导、细胞的分化和增殖和凋亡等。特别是在血管细胞的肥大,血管重塑,新生血管的形成中起重要的作用。2007年Mittal等首次报道NADPH氧化酶的各亚单位均在小鼠的肺部表达,其中NOX4表达最高,并提示NOX4可能参与慢性缺氧肺血管平滑肌细胞的增生且可能与慢性缺氧性肺动脉高压的发生机制有。 NO作为一种细胞信息分子,不仅可调节肺血管张力,而且可调控平滑肌增生和血管改建,从而在慢性缺氧性肺动脉高压形成过程中起重要的调节作用。肺血管内皮细胞由内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化产生的NO进入血管平滑肌细胞,激活可溶性鸟苷酸环化酶,使环鸟苷酸(cGMP)增加,导致cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化,通过降低细胞内的钙离子浓度,使平滑肌细胞松弛。在慢性缺氧条件下内皮起源的NO可以减轻肺血管平滑肌细胞的增生。 目前肺组织中NOX4在慢性缺氧肺动脉高压形成过程中表达的改变和作用研究较少。慢性缺氧对肺动脉血管内皮细胞eNOS表达的影响报道不一。慢性缺氧条件下小鼠肺部NOX4和eNOS表达的改变是否存相关性目前没有报道。本研究以C57BL/6J WT(+/+)小鼠为研究对象在慢性缺氧条件下形成肺动脉高压,观察小鼠肺组织中NOX4和eNOS表达改变,并比较常氧条件下WT(+/+)和eNOS(-/-)小鼠肺组织中NOX4基因表达的差异。从而探讨NOX4和eNOS之间的相互关系。 【方法】本实验将WT(+/+)c57BL/6J雄性小鼠40只随机分成5组分别是C1组(正常)、H1组(缺氧1天)、H3组(缺氧3天)、H7组(缺氧7天)、H14组(缺氧14天)。C57BL/6J WT(+/+)雄性小鼠8只,10周,为C2组,C57BL/6J近交系的eNOS(-/-)雄性小鼠8只,10周,为K组。将缺氧组放入自制的常压低氧箱中,以10±0.5%的氧浓度分别缺氧1、3、7、14天。C1、H1、H3、H7、H14组小鼠用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉后取肺组织,右肺各叶匀浆后用Real Time PCR法检测小鼠慢性缺氧前后肺组织中eNOS和NOX4 mRNA的改变。左肺以10%的中性福尔马林固定后做石蜡切片,再行HE染色和免疫组织化学染色法观察小鼠慢性缺氧前后肺大中动脉血管管壁形态学改变、非肌型小血管α—SMA和肺动脉血管内皮细胞eNOS表达的改变。C1和K组小鼠用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉后取肺组织,用Real Time PCR法检测两组小鼠NOX4 mRNA的表达。 【结果】WT(+/+)c57BL/6J小鼠慢性缺氧后肺大中动脉血管管壁增厚、非肌型小血管出现α—SMA染色阳性,非肌型小血管肌化、肺组织eNOS和NOX4 mRNA以及肺动脉内皮细胞eNOS蛋白的表达随缺氧时间进行性升高,两者的表达呈正相关。常氧条件下eNOS(-/-)小鼠肺组织中NOX4 mRNA的表达较WT(+/+)小鼠的高。 【结论】 1.慢性缺氧可使小鼠肺动脉血管发生重塑,肺血管中NOX4 mRNA、eNOS mRNA和蛋白表达升高。 2.小鼠肺组织中eNOS和NOX4的表达存在相互关系,在慢性缺氧条件下呈明显的正相关,eNOS基因敲除后小鼠肺组织中NOX4的表达升高。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R722.1
【图文】：

图1eNOS(一产)小鼠肺组织匀浆PCR产物2%琼脂糖电泳图。1.盯(+/+)小鼠2.eNOS。/一)小鼠3.Marker2C57BL/6JwT(+/+)小鼠慢性缺氧肺血管重塑2.1未经缺氧和经10士0.5%氧浓度慢性缺氧两周的C57BL/6J盯(+/+)小鼠肺组织石蜡包埋切片，HE染色见肺大中动脉血管壁增厚，官腔狭窄。(见图2)

eNOS(一产)小鼠肺组织匀浆PCR产物2%琼脂糖电泳图

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