Smad对树突状细胞TGF-β信号传导影响机制的初步研究

发布时间：2020-07-02 02:36

【摘要】： 第一部分HDM刺激小鼠肺SMAD蛋白表达 目的:探讨屋尘螨(HDM)气道刺激后,不同遗传背景小鼠肺组织SMAD蛋白表达有何不同。 方法:将A/J和C3H小鼠分别用HDM气道刺激,在最后一次刺激16小时后,取肺组织,经过匀浆处理,提取核蛋白,用western blot免疫印迹法检测肺组织蛋白中Smad2/3、Smad6的表达。 结果: A/J和C3H小鼠在HDM气道刺激16小时后,肺组织Smad6蛋白表达差异明显,表现为A/J小鼠Smad6升高,而C3H则呈现于A/J相反得变化,Smad6表达降低,而Smad2/3表达则正好相反,A/J降低,C3H增高。 结论:经HDM气道刺激后,不同遗传背景小鼠Smad表达有所差异,需要进一步研究验证其在TGF-β信号传导中的作用。 第二部分针对小鼠Smad6基因的RNA干扰 目的:针对目的基因Smad6 CDS区设计siRNA序列,构建表达载体,探讨感染后BMDC细胞中Smad6基因和蛋白表达状况。 方法:针对目的基因Smad6 CDS区设计三条siRNA序列,分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3 ,使用siRNA质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector进行siRNA表达载体构建,对构建成功的siRNA重组表达载体进行去内毒素质粒DNA抽提,siRNA重组表达载体DNA转染L929细胞,然后Real-time PCR的方法检测基因干预后L929细胞中Smad6基因表达状况,使用Lentivirus Pakage systerm进行慢病毒颗粒的包装和生产,测定病毒滴度(梯度稀释法),再分离C3H/HeJ小鼠骨髓原代BMDC,获取最佳MOI值以及感染条件,后用慢病毒感染BMDC细胞,RT-PCR和western blot分别检测感染后细胞中Smad6基因的表达及SMAD6蛋白表达状况。 结果: Real Time-PCR检测结果显示,siRNA1对于Smad6基因的沉默效果最好,沉默效率约为67%。考虑到细胞大约75%的转染效率,实际的基因沉默可能达到90%(mRNA),最佳MOI值为20,Real Time-PCR检测结果显示,通过病毒载体感染BMDC细胞,提示siRNA1对于Smad6基因的沉默效约为85%,而BMDC中蛋白表达被明显抑制,与对照组有差异有显著性。 结论:我们针对目的基因Smad6 CDS区所设计的siRNA序列而构建的表达载体能成功有效抑制Smad6基因和蛋白表达,为后一步的试验打下了基础。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R725.6
【图文】：

图 1-2 HDM 气道刺激后小鼠肺组织 Smad2/3 蛋白表达Fig 1-2 Active Smad2/3 expression in nucleus from whole lung cells从图中可以看出，没有经过 HDM 气道刺激的 A/J 和 C3H 小鼠 Smad2/3 表达基本没有差异，而经过 HDM 气道刺激后，二种小鼠均出现变化，具体表现为：A/J 下降，C3H 升高；而 HDM 刺激后 16 小时，A/J 和 C3H 的 Smad2/3 表达也存在明显差异。（统计学比较：A/J 未刺激与 2h、6h、16h 两两比较均有差异，C3H未刺激与 2h、6h 比较有差异，与 16h 比较有显著差异，2h、6h、16h 之 A/J 与 C3H比较有显著差异，p<0.05）。2.2 HDM 气道刺激诱导小鼠肺组织核内 Smad6 表达

010203040506070unchallenged 2 h 6 h 16 h分组密光度值A/JC3H***图 1-3 HDM 气道刺激后小鼠肺组织 Smad6 蛋白表达Fig 1-3 Smad6 expression in nucleus from whole lung cells* vs 未刺激 A/J(unchallenged A/J)** 16h C3H vs 16h A/J,p<0.05

【共引文献】

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本文编号：2737620