漆树酸改善压力过载致小鼠心肌肥厚的组蛋白乙酰化调控机制

发布时间：2020-07-04 01:29

【摘要】：第一部分压力过载对心肌肥厚相关基因组蛋白乙酰化修饰的影响目的:探讨组蛋白乙酰化酶(histone acetylases,HATs)p300(E1A-binding protein300kD,p300)和PCAF(P300/CBP-associated factor,PCAF)介导的组蛋白乙酰化修饰失衡引起心肌肥厚相关基因过表达在压力过载致小鼠心肌肥厚中的作用。方法:选取8周龄昆明小鼠为研究对象,按照随机数字表法随机分为正常组,假手术组及胸主动脉缩窄(thoracic aortic constriction,TAC)组,每组6只小鼠。TAC组进行部分胸主动脉结扎,假手术组只分离不结扎胸主动脉,其它处理同TAC组。8周后分别对三组小鼠进行如下检测:(1)心脏彩超观测左心室腔及心室壁厚度;(2)测量小鼠体重,随后颈椎脱臼法处死小鼠取心脏及肺脏组织,检测心脏指数(heart weight/body weight,HW/BW)及肺脏指数(lung weight/body weight,LW/BW);(3)体视镜观察小鼠心脏外形,苏木素-伊红(htoxylineosin,HE)染色观察心肌细胞形态的改变;(4)比色法检测HATs活性;(5)Western blot检测组蛋白H3K9ac乙酰化水平、HATs亚型p300和PCAF以及心肌肥厚标志物ANP、β-MHC蛋白表达水平;(6)实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测心脏核心转录因子MEF2A的mRNA表达水平。结果:(1)体视镜结果显示,TAC组小鼠心脏明显大于正常组,假手术组未见明显异常。(2)TAC组小鼠的心脏指数较正常组明显升高(P0.05),而肺脏指数较对照组相比无统计学差异(P0.05)。(3)HE染色结果显示,与正常组相比,TAC组小鼠心肌细胞明显增大,排列紊乱,纤维化明显。(4)心脏彩超结果显示,TAC组小鼠左心室腔较正常组明显缩小,且心室壁厚度明显增厚,而假手术组无显著改变。(5)比色法结果显示,TAC组小鼠心肌组织中HATs活性较正常组显著升高(P0.05),而假手术组无显著升高(P0.05)。(6)Western blot结果显示,TAC组小鼠与正常组小鼠相比,TAC组小鼠心肌组织中组蛋白H3K9ac乙酰化水平明显升高(P0.05),且HATs亚型p300、PCAF和心肌肥厚标志物ANP及β-MHC的蛋白表达水平在TAC组明显高于正常组(P0.05)。(7)Real-Time PCR检测结果显示,与正常组比较,TAC组小鼠心肌组织中心脏核心转录因子MEF2A的mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:(1)通过胸主动脉缩窄成功构建小鼠心肌肥厚模型。(2)压力过载致心肌肥厚小鼠心肌组织中HATs亚型p300、PCAF介导的组蛋白H3K9ac高乙酰化参与了心脏发育核心转录因子MEF2A及心肌肥厚相关标志物ANP和β-MHC的过表达。第二部分漆树酸通过调控组蛋白H3K9ac乙酰化修饰水平从而改善压力过载所致的小鼠心肌肥厚目的:探讨组蛋白乙酰化酶(histone acetylases,HATs)抑制剂漆树酸(anacardic acid,AA)改善压力过载致小鼠心肌肥厚的组蛋白乙酰化调控作用。方法:选取8周龄昆明小鼠为研究对象,按照随机数字表法随机分为正常组,胸主动脉缩窄(thoracic aortic constriction,TAC)组,TAC+AA组,TAC+二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)组,正常+AA组。TAC组结扎部分胸主动脉(约占胸主动脉直径70%)至术后8周。TAC+AA组是胸主动脉缩窄术后3周给予AA(5mg/kg)腹腔注射,每周注射3次至术后8周。TAC+DMSO组是胸主动脉缩窄术后3周给予同等剂量同等次数DMSO腹腔注射。正常+AA组是正常小鼠给予同等剂量同等次数AA腹腔注射至8周,收集各组小鼠心肌组织进行以下检测:(1)心脏彩超检测左室舒张末期及收缩末期的前壁厚度(LVAWT)、室间隔厚度(IVS)、左室舒张末期直径(LVEDD)、左室收缩末期直径(LVESD)和左室容积(LVV);(2)苏木素-伊红(htoxylineosin,HE)染色,观察小鼠心脏形态及心肌细胞表面积;(3)ChIP-Q-PCR检测心脏核心转录因子MEF2A启动子区域H3K9ac乙酰化水平及p300、PCAF结合量,同时探讨心脏核心转录因子MEF2A对心肌肥厚相关标志物基因ANP、β-MHC的调控作用;(4)实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测心脏核心转录因子MEF2A的mRNA表达水平;(5)Western blot检测组蛋白H3K9ac乙酰化水平、HATs亚型p300、PCAF蛋白及心肌肥厚标志物ANP、β-MHC的蛋白表达水平;(6)观察HATs抑制剂漆树酸对TAC术后小鼠生存率及心脏射血分数的影响。结果:(1)心脏彩超结果显示,TAC+AA组与TAC组比较,LVAWT、IVS、LVEDD、LVESD和LVV等指标均有显著改善,差异有统计学意义(均P0.05);而TAC+DMSO组相较于TAC组差异无统计学意义(均P0.05)。(2)HE染色结果显示,TAC+AA组较TAC组小鼠心肌肥厚程度有明显改善,心肌细胞表面积显著减小(P0.05),而TAC组与TAC+DMSO组比较小鼠心肌肥厚程度及心肌细胞表面积并无显著改变(P0.05)。(3)ChIP-Q-PCR结果表明,小鼠心肌组织中心脏核心转录因子MEF2A启动子区域p300、PCAF的结合量在TAC组显著高于对照组(P0.05);MEF2A启动子区域组蛋白H3K9ac的乙酰化水平在TAC组较对照组显著升高(P0.05);而TAC+AA组心脏核心转录因子MEF2A启动子区域p300、PCAF的结合量及组蛋白H3K9ac乙酰化水平较TAC组显著下降(均P0.05),而TAC+DMSO组较TAC组差异无统计学意义(均P0.05)。(4)Real-Time PCR结果显示,漆树酸能够显著下调TAC小鼠心脏核心转录因子MEF2A mRNA的表达水平(P0.05),而TAC+DMSO组与TAC组比较差异无统计学意义(P0.05)。(5)Western blot检测结果显示,与TAC组比较,TAC+AA组组蛋白H3K9ac乙酰化水平明显下调(P0.05),而TAC+DMSO组H3K9ac乙酰化水平较TAC组无显著变化(P0.05)。同时,TAC+AA组HATs亚型p300、PCAF及心肌肥厚标志物ANP、β-MHC蛋白表达水平较TAC组均有明显下调(均P0.05),TAC+DMSO组较TAC组差异无统计学意义(均P0.05)。结论:(1)HATs亚型p300、PCAF介导的组蛋白H3K9ac高乙酰化参与了压力过载诱导的小鼠心肌肥厚。(2)HATs抑制剂漆树酸能够通过抑制p300及PCAF介导的组蛋白H3K9ac高乙酰化来调控心肌肥厚相关基因的表达水平进而改善压力过载诱导的小鼠心肌肥厚。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.4
【图文】：

β-actinNM_114614.2TGAGAGGGAAATCGTGCGTGACGCTCGTTGCCAATAGTGATGACMEF2ANM_172582.2CACTTCCTTGGACTACTTGTTTCGTGTTCCTGCTTTTCTACTGCTCTTT3）相对定量分析：以β-actin 作为对照，运用 LERTPA-V1.0 软件进行结果分析，并采用 2-deltadeltaCT（Livak 法）进行数据分析。2 结果2.1 心脏彩超检测小鼠心肌肥厚相关指标心脏彩超观察结果显示，TAC 组小鼠的心室腔与正常组比较，明显缩小且心室壁厚度明显增厚，而假手术组无明显改变。如图 1.1 所示。

体视镜结果表明：TAC组小鼠心脏组织较对照组明显肥大，且明显增重（图1.2-A）。H&E染色结果显示：心脏冠状切面表明TAC组小鼠心脏较对照组明显肥大且心室腔变小（图1.2-B）。图1.2-C为H&E染色后心肌细胞纵切图，实验结果显示TAC组较对照组心肌细胞明显增大、排列紊乱。

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本文编号：2740439