HCMV感染对HEL细胞细胞周期相关因子Cdt1与Geminin表达的影响
发布时间：2020-07-09 07:08
【摘要】： 目的研究人胚肺成纤维(human embryonic lung fibroblastic，HEL)细胞细胞周期相关因子Cdt1与Geminin的表达状态及人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染对两者表达的影响，探讨HCMV感染可能的发病机制。 方法用血清饥饿法同步化HEL细胞于G_0／G_1期，流式细胞术检测细胞周期；用HCMV感染同步化的HEL细胞作为感染组，同时设模拟感染组为对照组。用倒置相差显微镜观察两组细胞形态学变化至感染后168小时。于感染后12h(hour)、24h、48h、72h和96h收获细胞，提取总的RNA，采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)技术检测Cdt1-mRNA和Geminin-mRNA的表达水平。 结果 1、模拟感染组未见细胞形态学改变，感染组感染后36h即可见局部细胞变圆、膨胀，胞体及胞核巨大化，168h时可见所有细胞均发生病变。2、分别用含O．5％，1％，2％和10％新生牛血清的DMEM培养基培养HEL细胞，48小时后收获细胞，结果显示处于G_0／G_1期的HEL细胞所占百分数分别为82.8％，78.4％，69.9％，43.8％。新生牛血清浓度为0.5％时，细胞同步化较理想，所同步化的HEL细胞可用于试验。 3、12h、24h、48h和72h两组HEL细胞Cdt1-mRNA表达水平均有显著性差异(P＜0.05)，12h和24h感染组较模拟感染组明显降低，48h和72h时感染组较模拟感染组明显升高。将其制成时间与Cdt1-mRNA表达水平线图显示，模拟感染组在感染后12h时Cdt1-mRNA表达水平最高，感染组在感染后48h达最高峰。 4、12h、24h、48h和72h两组HEL细胞Geminin-mRNA表达水平均有显著性差异(P＜0.05)，12h和24h感染组较模拟感染组明显增加，48h和72h时模拟感染组较感染组明显升高。将其制成时间与Geminin-mRNA表达水平线图显示，感染组在感染后12h时Geminin-mRNA表达水平最高，模拟感染组在感染后48h达最高峰。 结论： 1、血清饥饿法将绝大部分HEL细胞同步于G_0／G_1期，0.5％新生牛血清的DMEM培养基饥饿HEL细胞同步化效果较佳。 2、HCMV能诱导Cdt1及Geminin因子表达异常，使Geminin／Cdt1平衡失调，这可能是HCMV感染导致细胞周期阻滞于G_1期的机制。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R725.1
【图文】：
1、感染后两组HEL细胞形态学的改变镜下观察100TCIDS。的 HCMVAD.。。株感染G。/G，期同步的HEL细胞36h后，可见有小灶状细胞体积膨胀变圆，并遂渐向四周扩散(图3一1)。随感染时间的延长病变加重，于168h后，全部细胞发生病变“++++”(图3一2)。而模拟感染组HEL细胞在各时间点均未见形态学改变，呈纤维状，细胞核椭圆形(图3一3)。图3一 1HCMV感染36h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一 2HCMy感染168h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一3模拟感染组HEL细胞未见形态学改变(”100)2、流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期结果为:新生牛血清浓度为0.5%，1%，2%及10%的DMEM培养基诱发细胞同步化处于G0/G;期细胞的百分率分别为82.8%(图3一4)70.4%(图3一5)，69.9%(图3一6)，43.8%(图3一7)。 00000O‘今曰曰己11﨑。Nquln一一。Ot二》r、丁2月‘《二李《:
图3一 1HCMV感染36h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一 2HCMy感染168h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一3模拟感染组HEL细胞未见形态学改变(”100)2、流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期结果为:新生牛血清浓度为0.5%，1%，2%及10%的DMEM培养基诱发细胞同步化处于G0/G;期细胞的百分率分别为82.8%(图3一4)70.4%(图3一5)，69.9%(图3一6)，43.8%(图3一7)。O‘今曰曰
3.1RNA抽提结果紫外分光光度计测总RNA的OD值，0D260/OD280比值为1.8~2.0，表明所提总RNA浓度和纯度较高，从1.5%的琼脂糖凝胶电泳图观察总RNA的质量(图3一8)，可作为逆转录的模板。281855S图3一8总RNA电泳图注:泳道1、2分别表示模拟感染组及感染组所提取RNA 3.2CdtlmRNA与p一 aetinmRNA同管扩增产物以逆转录后的cDNA为模板，将Cdt卜mRNA与p一 actinmRNA同管扩增，扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，于近SOObp和300bp处分别可见一目的条带出现(图3一9)。
本文编号：2747128
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R725.1
【图文】：
1、感染后两组HEL细胞形态学的改变镜下观察100TCIDS。的 HCMVAD.。。株感染G。/G，期同步的HEL细胞36h后，可见有小灶状细胞体积膨胀变圆，并遂渐向四周扩散(图3一1)。随感染时间的延长病变加重，于168h后，全部细胞发生病变“++++”(图3一2)。而模拟感染组HEL细胞在各时间点均未见形态学改变，呈纤维状，细胞核椭圆形(图3一3)。图3一 1HCMV感染36h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一 2HCMy感染168h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一3模拟感染组HEL细胞未见形态学改变(”100)2、流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期结果为:新生牛血清浓度为0.5%，1%，2%及10%的DMEM培养基诱发细胞同步化处于G0/G;期细胞的百分率分别为82.8%(图3一4)70.4%(图3一5)，69.9%(图3一6)，43.8%(图3一7)。 00000O‘今曰曰己11﨑。Nquln一一。Ot二》r、丁2月‘《二李《:
图3一 1HCMV感染36h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一 2HCMy感染168h后HEL细胞形态变化 (x100)图3一3模拟感染组HEL细胞未见形态学改变(”100)2、流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期流式细胞术检测血清饥饿后的HEL细胞周期结果为:新生牛血清浓度为0.5%，1%，2%及10%的DMEM培养基诱发细胞同步化处于G0/G;期细胞的百分率分别为82.8%(图3一4)70.4%(图3一5)，69.9%(图3一6)，43.8%(图3一7)。O‘今曰曰
3.1RNA抽提结果紫外分光光度计测总RNA的OD值，0D260/OD280比值为1.8~2.0，表明所提总RNA浓度和纯度较高，从1.5%的琼脂糖凝胶电泳图观察总RNA的质量(图3一8)，可作为逆转录的模板。281855S图3一8总RNA电泳图注:泳道1、2分别表示模拟感染组及感染组所提取RNA 3.2CdtlmRNA与p一 aetinmRNA同管扩增产物以逆转录后的cDNA为模板，将Cdt卜mRNA与p一 actinmRNA同管扩增，扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，于近SOObp和300bp处分别可见一目的条带出现(图3一9)。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 刘志峰;巨细胞病毒对细胞周期的影响及其机制[J];国外医学.病毒学分册;2002年04期
2 李建华;陈利玉;;人巨细胞病毒主要立即早期蛋白功能研究进展[J];实用预防医学;2006年04期
3 宋春娇,吕冰洁,张小玲,史忠诚,傅松滨,李璞,李钰;血清饥饿法用于细胞周期同步化的方法学研究[J];中国地方病学杂志;2003年04期
本文编号：2747128
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