miRNA-199b-5p对免疫性冠状动脉炎小鼠NF-κB表达及其信号通路的影响

发布时间：2020-07-12 14:42

【摘要】：第一部分:免疫性冠状动脉炎小鼠血浆炎症因子及血液单个核细胞中miRNA-199b-5p的动态变化目的:观察免疫性冠状动脉炎小鼠血浆炎症因子及血单个核细胞中miRNA-199b-5p的动态变化,预测相关靶基因,为研究免疫性冠状动脉炎的发病机制提供基础。方法:1.分别连续5天给予C57BL/6小鼠腹腔注射白色念珠菌水溶物(8mg/只)或磷酸盐缓冲液(0.1ml/只)。注射后不同时间点(24h、3d、7d、14d、28d)处死小鼠,采血,留取心脏及冠状动脉标本,检测血常规、制备心脏病理切片,确定小鼠免疫性冠状动脉炎模型制作成功。2.分离小鼠血浆标本,酶联免疫吸附实验法测定血浆中IL-6、TNF-α水平。Trizol法提取外周血单个核细胞中总RNA,采用实时定量PCR技术测定其中IL-6、TNF-αmRNA及miRNA-199b-5p水平。3.利用PITA、Target Scan和micro RNAorg数据库进行miRNA-199b-5p靶基因预测,DAVID生物信息学软件对共同靶基因行GO和KEGG分析,获取与免疫性血管炎相关的靶基因。结果:1.小鼠免疫性冠状动脉炎模型成功建立。2.实验组小鼠血浆IL-6、TNF-α水平,在注射后3d、7d时升高(P均0.05)。单个核细胞中IL-6、TNF-αmRNA水平在注射后3d、7d时升高(P均0.05),miRNA-199b-5p水平在注射后24h、3d、7d、14d时降低(P均0.05)。3.数据库预测获得共有90个共同的靶基因,其中与免疫性血管炎有关的为NFKB。结论:1.连续5天腹腔注射白色念珠菌水溶物8mg/只,是构建免疫性冠状动脉炎小鼠模型的合适方法。2.IL-6、TNF-α是参与了免疫性冠状动脉炎的炎症因子。3.miRNA-199b-5p可能通过调控NF-κB靶基因表达,参与冠状动脉炎症的病理过程。第二部分:免疫性冠状动脉炎小鼠血液单个核细胞中miRNA-199b-5p表达与NF-κB及其信号通路相关性研究目的:分析miRNA-199b-5p和NF-κB在冠状动脉炎小鼠中的表达及其意义,探讨miRNA-199b-5p与NF-κB在免疫性冠状动脉炎中的作用及二者之间的关系。方法:实验组C57BL/6小鼠腹腔注射CAWS制作免疫性冠状动脉炎动物模型,对照组小鼠腹腔内注射等体积PBS。分别于注射后24h、3d、7d、14d及28d采集血液,留取其心脏标本。检测:1.RT-qPCR技术检测两组小鼠不同日龄血液单个核细胞中miRNA-199b-5p表达量及NF-κB的mRNA表达水平。2.EVG染色检测小鼠血管弹力纤维改变情况。免疫组织化学测定NF-κB在血管内皮细胞中分布情况的变化。3.Western blot法检测血液单个核细胞中NF-κB蛋白表达水平。比较不同日龄免疫性冠状动脉炎小鼠及对照组间miRNA-199b-5p与NF-κB表达差异,分析二者变化的相关性。结果:1.急性期(3d、7d)实验组小鼠单个核细胞中NF-κB的mRNA表达水平明显高于对照组(p0.05),亚急性期(14d、28d)差异无统计学意义(p0.05)。2.小鼠心脏EVG染色显示亚急性期(14d)出现血管弹力纤维破坏。实验组(24h、3d、7d、14d)小鼠免疫组织化学染色显示血管内皮细胞核NF-κB-p65水平明显高于对照组(p0.05);实验组(3d、7d、14d)小鼠血液单个核细胞Western Blot显示NF-κB水平明显高于对照组(p0.05),28d组差异无统计学意义(p0.05)。3.实验组小鼠血液单个核细胞中miRNA-199b-5p表达量与NF-κB水平呈负相关。结论:1.冠状动脉炎小鼠血液单个核细胞、血管内皮细胞中存在NF-κB表达的上调。2.miRNA-199b-5p可能通过改变靶基因NF-κB的表达,调控小鼠免疫性血管炎的炎症反应。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.4
【图文】：

程后期14、28d时实验组小鼠体重均渐恢复，与对照组相比无明显统计学意义。实验组小鼠注射结束后24h及3d时体质量降低变化，7d时的心脏质量降低变化，与对照组相比，差别有统计学意义（P<0.05），结果如下图1-1（table1、2）：图1-1图1-1注：Table1：显示小鼠体质量比较:**: P<0.01，*: P<0.05，左侧条为对照组，右侧条为实验组。Table2：显示小鼠心脏质量比较:*: P<0.05，左侧条为对照组，右侧条为实验组。1.2 冠状动脉炎小鼠血常规改变实验组小鼠白细胞及血小板均值均高于对照组。白细胞及血小板值在两组间差异在注射刺激物后24h、3d、7d有统计学意义（P<0.05）。结果如下图1-2（table3、4）：图1-2图1-2注：Table3：小鼠血常规白细胞值:**: P<0.01，*: P<0.05，左侧条为对照组，右侧条为实验组。Table4：小鼠血常规血小板值:*: P<0.05，左侧条为对照组，右侧条为实验组。1.3 小鼠冠状动脉组织病理学改变1.3.1 HE 染色。对照组：血管内皮完整光滑

1.2 冠状动脉炎小鼠血常规改变实验组小鼠白细胞及血小板均值均高于对照组。白细胞及血小板值在两组间差异在注射刺激物后24h、3d、7d有统计学意义（P<0.05）。结果如下图1-2（table3、4）：图1-2图1-2注：Table3：小鼠血常规白细胞值:**: P<0.01，*: P<0.05，左侧条为对照组，右侧条为实验组。Table4：小鼠血常规血小板值:*: P<0.05，左侧条为对照组，右侧条为实验组。1.3 小鼠冠状动脉组织病理学改变1.3.1 HE 染色。对照组：血管内皮完整光滑，内膜下弹力纤维完整，无明显炎症细胞浸润（见图 1-3：A）。实验组：急性期（3d）可见血管内皮粗糙，有明显炎症细胞

图 1-3 注：免疫性血管炎病理改变（HE 染色）：A：对照组。（HE×200）（对照组红色箭头：内膜光滑的冠状动脉）。B：实验组（HE×200）。（注射 CAWS 后 3d，红色箭头：内皮细胞肿胀、内膜毛糙的冠状动脉）。C：实验组（HE×200）。（注射 CAW后 14d，蓝色箭头：血管内膜及弹力纤维损伤，红色箭头：炎症肿胀的血管）。按照 Oharaseki T[7]的方法，按血管炎症程度等级给予 0、1、2、3 分的评分，以Ridit 分析法半定量分析，随着 CAWS 刺激中止后日龄的变化，血管损伤在 14d 最重28d 渐恢复。与对照组比较，有统计学意义（P<0.01），见表 1-7：表 1-7：各组小鼠血管炎症损伤评分（n=6， x±s）组别 血管损伤分值对照组 0.00±0.0024h 0.73±0.43*3d 1.14±0.36*7d 2.26±0.45*14d 2.38±0.52*

【参考文献】

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本文编号：2752105