轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装

发布时间：2020-07-14 15:22

【摘要】： A组轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体,几乎所有儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒,每年因感染轮状病毒而导致的婴幼儿腹泻高达2亿,住院人数超过200万,死亡高达100万人,仅在美国,每年因轮状病毒而产生的医疗费用就高达1亿美元。 自1973年轮状病毒在人体发现以来,各国科研人员对其进行了大量的研究,对其结构和感染机制的研究日益深入,但到目前为止,尚无针对轮状病毒的特效药物,因此,快速、准确的诊断和安全、有效的疫苗对控制轮状病毒的感染极其重要。病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs)作为轮状病毒的候选疫苗具有广阔的发展前景,对进一步研究轮状病毒的感染机制和组装机制也具有重要的意义。 我们在大肠杆菌中表达了轮状病毒的结构蛋白VP2,首次在体外成功的组装了轮状病毒核心样颗粒(Core-like Particle,CLP)并初步研究了环境因素对其稳定性的影响,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础;通过缺失突变研究了VP6的自身相互作用的区域,发现243-334aa为VP6形成三聚体的最小区域,通过定点突变研究了半胱氨酸在VP6聚体形成中的作用并通过免疫印迹研究了缺失突变和定点突变对VP6免疫反应性的影响,通过同源建模构建了VP6的结构并分析了定点突变对VP6结构的影响;构建了VP4和VP7的表达质粒;此外,还制备了轮状病毒的单克隆抗体,初步实验证实7H11、2A9和5C2具有较好的广谱性和特异性。该研究为轮状病毒VLP的体外组装及VLP疫苗的研究奠定了基础,对进一步研究轮状病毒的感染机制和组装机制也具有重要的意义。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R725.1
【图文】：

图1轮状病毒电镜图(左171)、脱衣壳过程(右上181)和结构示意图(右下191)Fig1EleetronMierograPhandSehematies(right)ofRotavirus

轮状病毒腹泻及其全球分布

全长的VPZ对蛋白酶较为敏感，N端43aa、92aa以及368aa附近存在蛋白酶作用位点，为了在大肠杆菌中获得高效表达的稳定的VPZ，同时研究CLP的体外组装机制，设计了多个亚克隆(图6)。 2.1.2VPZ基因的克隆通过PCR扩增RV结构蛋白的目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见特异性的DNA条带(图7)，通过小量胶回收试剂盒回收目的DNA，连接PMD18一T，酶切鉴定正确后送博亚生物工程公司测序。

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本文编号：2755139