错义突变MTUS1通过微管相关通路影响心肌致密化过程的机制研究
发布时间：2020-07-15 04:32
【摘要】：目的:探讨微管相关错义突变基因微管相关肿瘤抑制因子1(Microtubule-associated tumor suppressor 1,MTUS1)在心肌致密化发生过程中的作用,初步阐述心肌致密化不全的遗传学发生机制。方法:首先在CP15-5a细胞系水平构建过表达慢病毒突变组LV-M-MTUS1、野生组LV-W-MTUS1及空载组CON,采用RT-PCR技术检测各组MTUS1及小GTP酶RhoA(ras homolog family member A,RhoA)的mRNA表达水平,Western blot技术检测各组RhoA蛋白表达水平,细胞免疫荧光技术检测各组α-tubulin荧光表达强度,并对各组细胞进行细胞划痕实验,检测其细胞迁移情况;其次在HEK-293细胞系水平构建过表达慢病毒突变组LV-M-MTUS1、野生组LV-W-MTUS1及空载组CON,采用RT-PCR技术检测各组MTUS1 mRNA表达水平,细胞免疫荧光技术检测各组α-tubulin、α/β-tubulin及极性蛋白PAR6的荧光表达强度及细胞定位情况,同时根据α-tubulin荧光结果检测HEK-293细胞分裂期子代细胞纺锤体到胞膜的距离及分裂后子代细胞大小,Western blot技术检测各组Rac1/Cdc42蛋白磷酸化表达水平。结果:成功构建过表达慢病毒突变组、野生组及空载组CP15-5a及HEK-293细胞模型;在CP15-5a细胞模型中,突变组与野生组相比,细胞α-tubulin荧光强度表达下降(P0.01),细胞内α-tubulin较稀疏、紊乱。与野生组相比,突变组RhoA的mRNA及蛋白表达水平明显增高(P0.01)。划痕实验结果显示,与野生组相比,在划痕后6 h、12 h突变组细胞迁移速率增快(P0.01);在HEK-293细胞模型中,突变组及野生组MTUS1 mRNA表达明显升高(P0.05);突变组与野生组相比,细胞α-tubulin荧光强度表达下降(P0.01),作为运输作用的α/β-tubulin荧光强度表达升高(P0.01),并且在细胞质内有浓聚的表现;同时极性蛋白PAR6在突变组细胞内表达增加(P0.01),定位更偏向细胞膜侧;根据α-tubulin细胞免疫荧光结果,突变组分裂期子代细胞纺锤体到胞膜的距离差值较野生组的距离差值明显增加(P0.01),并且突变组分裂末期的子代细胞体积较野生组明显增加(P0.01);突变组与野生组相比,磷酸化Rac1/Cdc42蛋白表达下降(P0.01)。结论:在CP15-5a细胞模型中,错义突变MTUS1能够降低细胞微管稳定性,并通过升高RhoA mRNA及蛋白水平,进而影响细胞迁移能力;在HEK-293细胞模型中,错义突变MTUS1影响α-tubulin表达,降低细胞微管稳定,进而影响细胞极性分裂情况,其可能的作用机制是微管稳定性降低后,进一步降低Rac1/Cdc42磷酸化蛋白水平,使调控运输的α/β-tubulin蛋白表达增加,促进PAR6蛋白从胞质运输至胞膜位置,导致细胞极性分裂趋势增加;综上,错义突变MTUS1可促进心肌致密化的进程,从而降低或者缓解心肌致密化不全的发生风险,是心肌致密化不全发生的保护性突变。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.4
【图文】：
Table 4 5% SDS-PAGE spacer gel （6ml）试剂名称 加入体积（ml）ddH2O 4.130%Acr-Bis(29:1) 11M Tris, pH6.8 0.7510%SDS 0.0610%AP 0.06TEMED 0.006方法 实验技术路线
图 1-2 考马斯亮蓝标准曲线 Y=0.0695X+0.1453 相关性 R2=0.9906Figure 1-2 The standard curve of Bradford，Y=0.0695X+0.1453，R2=0.99.2 蛋白浓度测定）空白孔加 195 μl 考马斯蓝试剂，ddH2O 补齐至 200 μl；样本孔试剂，2 μl 样本，ddH2O 加 3 μl，反应体系总体积为 200 μl；）移液枪吹匀反应液，注意不要产生气泡，置于酶标仪测定 OD3 ） 根 据 考 马 斯 蓝 标 准 曲 线 测 得 系 数 ， 带 入 下 述 公 ，求得数值即为蛋白浓度（μg/μl）。 Western blot 检测各组细胞 GFP 蛋白表达水平）配胶：
先证者姑姑；2：先证者父亲；3：先证者母亲；4：先证者：5：先证者图 1-1 LVNC 家系Figure 1-1 LVNC family pedigreeitus’ aunt; 2. Propositus’ father; 3. Propositus’ mother; 4. Propositus; 5. sister(1）、（3）、（4）、（5）分别对应家系图谱
本文编号：2755985
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.4
【图文】：
Table 4 5% SDS-PAGE spacer gel （6ml）试剂名称 加入体积（ml）ddH2O 4.130%Acr-Bis(29:1) 11M Tris, pH6.8 0.7510%SDS 0.0610%AP 0.06TEMED 0.006方法 实验技术路线
图 1-2 考马斯亮蓝标准曲线 Y=0.0695X+0.1453 相关性 R2=0.9906Figure 1-2 The standard curve of Bradford，Y=0.0695X+0.1453，R2=0.99.2 蛋白浓度测定）空白孔加 195 μl 考马斯蓝试剂，ddH2O 补齐至 200 μl；样本孔试剂，2 μl 样本，ddH2O 加 3 μl，反应体系总体积为 200 μl；）移液枪吹匀反应液，注意不要产生气泡，置于酶标仪测定 OD3 ） 根 据 考 马 斯 蓝 标 准 曲 线 测 得 系 数 ， 带 入 下 述 公 ，求得数值即为蛋白浓度（μg/μl）。 Western blot 检测各组细胞 GFP 蛋白表达水平）配胶：
先证者姑姑；2：先证者父亲；3：先证者母亲；4：先证者：5：先证者图 1-1 LVNC 家系Figure 1-1 LVNC family pedigreeitus’ aunt; 2. Propositus’ father; 3. Propositus’ mother; 4. Propositus; 5. sister(1）、（3）、（4）、（5）分别对应家系图谱
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 谢朝晖;陈兰英;;细胞骨架研究进展[J];癌变·畸变·突变;2011年04期
本文编号：2755985
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/eklw/2755985.html
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