急性白血病儿童维生素D受体基因多态性和表达及维生素D对白血病细胞的影响

发布时间：2020-07-17 01:57

【摘要】：目的研究维生素D受体(VDR)基因FokI、BsmI、ApaI和TaqI位点多态性在广西地区儿童的分布,分析VDR基因多态性与儿童急性白血病(AL)遗传易感性之间的关系,以进一步了解AL的分子生物学机制。方法采用病例-对照的研究方法,在中国广西地区选取无血缘关系的127例AL儿童和268例健康体检儿童(作为对照组)作为研究对象,采集外周血,提取DNA,采用聚合酶链限制性片段长度多态性技术和基因测序技术,对两组儿童FokI、BsmI、ApaI和TaqI位点多态性进行分析。采用二项分布检验,对两组数据进行Hardy-Weinberg遗传平衡分析。组间频率比较采用χ2检验,以比值比(OR)及95%可信区间(CI)表示相对风险度。采用SHEsis软件进行VDR基因多态性位点连锁不平衡的计算。结果样本经遗传平衡检验表明,各基因型的观察值与期望值之间无显著性差异(P0.05),说明所选的样本具有代表性。268例健康儿童VDR基因FokI位点ff、Ff和FF基因型频率分别为22.02%、48.13%和29.85%;f、F等位基因频率为46.08%和53.92%。BsmI位点bb、Bb和BB基因型频率分别为91.79%、7.84%和0.37%;b、B等位基因频率为95.71%、4.29%。ApaI位点aa、Aa和AA基因型频率分别为52.61%、36.57%和10.82%;a、A等位基因频率为70.90%、29.10%。TaqI位点tt、Tt和TT基因型频率分别为0%、9.70%和90.30%;t、T等位基因频率为4.85%、95.15%。结果显示广西地区健康儿童FokI、BsmI、ApaI和TaqI位点多态性分布情况与国内其它地区分布基本一致。127例AL儿童ff、Ff和FF基因型频率分别为35.43 %、43.31%和21.26%;f、F等位基因频率为57.09%、42.91%。bb、Bb和BB基因型频率分别为92.13%、7.87%和0;b、B等位基因频率为96.06%、3.94%。aa、Aa和AA基因型频率分别为48.82%、37.01%和14.17%;a、A等位基因频率为67.32%、32.68%。tt、Tt和TT基因型频率分别为0、11.81%和88.19%;t、T等位基因频率为5.91%、94.09%。FokI位点ff基因型在AL儿童的分布较健康儿童明显增高。与FF基因型相比,ff基因型患AL的风险性增加(OR=2.260,P0.05);与F等位基因相比,携带f等位基因的个体更易罹患AL(OR=1.556,P0.05)。BsmI、ApaI和TaqI位点多态性分布在病例组与对照组之间无显著性差异。FokI和BsmI、ApaI、TaqI位点之间不存在明显的连锁不平衡。结论中国广西地区儿童VDR基因多态性分布频率有其自身的特点。VDR基因FokI位点SNP可能是急性白血病发生的遗传易感因素之一,携带f等位基因的个体更易罹患急性白血病。VDR基因BsmI、ApaI和TaqI酶切位点的多态性可能与儿童白血病的遗传易感性无关。此结论仍需进一步行大样本实验证实。目的通过检测AL儿童VDR基因和蛋白的表达,从转录和翻译两个水平探讨VDR在AL中表达的意义,揭示VDR的表达与AL分类的可能联系。方法收集未经治疗的30例急性淋巴细胞白血病(ALL)和12例急性髓细胞白血病(AML)儿童、30例非肿瘤性血液病儿童(包括缺铁性贫血、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜等,作为对照组)的骨髓标本,抽提总RNA,提取得到的RNA采用M-MLV逆转录试剂盒逆转录合成cDNA第一链,以逆转录得到的cDNA为模板,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,检测VDR基因mRNA的表达。扩增产物的特异性通过熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳双重确认。以管家基因GAPDH基因为内参照,采用2-△△Ct法计算VDR mRNA的相对表达量,得到标化的VDR mRNA的表达。利用超敏S-P免疫细胞化学法检测了其中9例AL儿童和4例对照组骨髓细胞VDR的表达。收集未经治疗的30例ALL、10例AML和30例健康体检儿童(作为对照组)的外周血标本,提取单个核细胞(MNCs),取适量立即涂片应用免疫细胞化学法检测VDR的表达和定位情况;其余的MNCs用细胞裂解液抽提全细胞蛋白样品用于蛋白免疫印迹法检测VDR蛋白的相对表达量。用单因素方差分析比较ff、Ff和FF三种基因型VDR mRNA和蛋白表达的差异。对AL儿童VDR的表达和外周血白细胞、血小板的关系进行一元线性相关分析。结果VDR mRNA在所有检测的AL儿童和对照组儿童的骨髓中均有表达。ALL儿童VDR mRNA的表达(1.06±0.31)和AML的表达(1.13±0.34)明显低于对照组儿童的表达(3.10±0.18),组间有显著性差异(F=1701.00,P0.01),而ALL和AML之间的表达无统计学差异(P0.05)。经一元线性相关分析,结果显示42例AL儿童VDR mRNA的表达水平与外周血白细胞数无明显相关性(r=0.045, P=0.078),与外周血血小板数亦无明显相关性(r=0.067, P=0.675)。对42例AL儿童ff、Ff和FF三种基因型进行VDR mRNA表达的比较,VDR mRNA的表达分别为1.25±0.47(n=12),1.12±0.41(n=17),1.09±0.38(n=13),组间比较无统计学差异(F=0.489,P 0.05)。免疫细胞化学法显示所检测样本的骨髓和外周血MNCs均表达VDR蛋白,VDR蛋白主要分布在细胞核内。被检测的9例AL儿童骨髓VDR蛋白的表达(30.80±1.56%)低于4例对照组儿童的表达(62.45±3.73%),由于样本例数太少,未作统计学分析。30例ALL儿童外周血VDR蛋白的表达(27.82±1.78%)和10例AML的表达(27.10±2.44%)明显低于30例健康儿童(59.02±3.46%),组间有显著差异(F=1150.26,P0.01),而ALL和AML儿童中VDR蛋白的表达无统计学差异(P0.05)。蛋白免疫印迹法亦显示相似结果:ALL儿童VDR蛋白的表达(0.299±0.071)和AML的表达(0.290±0.094)明显低于健康儿童(0.710±0.041),组间有显著差异(F=356.434,P 0.01),而ALL和AML儿童VDR蛋白的表达无统计学差异(P0.05)。一元线性相关分析显示40例AL儿童VDR蛋白的表达水平与外周血白细胞数无明显相关性(r=-0.133, P=0.413),与外周血血小板数亦无无直线相关关系(r=0.006,P=0.917)。病例组40例AL儿童ff、Ff和FF基因型VDR蛋白的表达分别为0.286±0.061(n=13),0.289±0.079(n=17), 0.324±0.089(n=10),组间比较无统计学意义(F=0.853,P0.05)。结论所有检测的AL儿童的骨髓和外周血MNCs均表达VDR,考虑白血病细胞是VDR 作用的靶细胞。AL儿童VDR mRNA和蛋白的表达较健康儿童明显降低,考虑VDR的表达情况可能成为AL诊断的有效指标。VDR的表达可能与AL分类、VDR基因型和初治时外周血象无关。目的研究不同浓度的1,25二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)对人白血病细胞株6T-CEM和HL-60生长、分化和凋亡的影响,并观察1,25(OH)2D3处理前后6T-CEM和HL-60细胞VDR mRNA和蛋白表达的变化,探讨其抗白血病的分子机制及用于白血病治疗的可行性。方法在体外培养条件下,用不同浓度(10-9,10-8,10-7,10-6 mol/L)的1,25(OH)2D3作用处于对数生长期的6T-CEM和HL-60。应用台盼蓝拒染法计数活细胞,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法分析细胞增殖抑制作用,硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验法分析HL-60细胞的分化指标,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色法(TUNEL)检测细胞晚期凋亡的变化,倒置显微镜及赖-吉染色法(Wright-Giemsa)观察细胞形态学改变,运用RT FQ-PCR方法检测VDR mRNA变化,免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹技术检测VDR蛋白表达。结果MTT法显示不同浓度的1,25(OH)2D3作用后可抑制6T-CEM及HL-60细胞的生长,呈剂量和时间依赖性。不同浓度的1,25(OH)2D3作用后可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化,对6T-CEM的分化无影响。TUNEL法显示1,25(OH)2D3作用后对6T-CEM和HL-60细胞有明显的促细胞凋亡作用,凋亡率随药物浓度的增高而增高。细胞形态学观察发现药物作用后细胞表现出凋亡的形态特征。1,25(OH)2D3作用前后6T-CEM和HL-60细胞均表达VDR mRNA和蛋白,药物作用前后VDR mRNA表达改变不明显,而VDR蛋白表达上调。结论1,25(OH)2D3在一定浓度范围内可抑制6T-CEM和HL-60细胞增殖,诱导细胞凋亡。1,25(OH)2D3可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化。1,25(OH)2D3可使6T-CEM和HL-60细胞VDR蛋白表达上调,但不改变VDR mRNA水平。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R733.7
【图文】：

琼脂糖电泳,电泳带,基因,基因型

图 1-1 VDR 基因 PCR 产物琼脂糖电泳结果Figure 1-1 The AGE result of VDR gene PCR product.2 PCR-RFLP 结果PCR 反应产物经相应的限制性内切酶作用后，经琼脂糖凝胶电泳,根据切得到的 DNA 片段长度判断基因型(图 1-2)。用小写字母表示存在酶切位，大写字母表示缺乏酶切位点。分型标准：FF 基因型有一条电泳带246bp)，ff 基因型有两条电泳带(195bp、51bp)，Ff 基因型有三条电泳带246bp、 195bp、51bp)；BB 基因型有一条电泳带(577bp),bb 基因型有两电泳带(411bp、166bp)，Bb 基因型有三条电泳带(577bp、411bp、166bp)；A 基因型有一条电泳带(745bp)，aa 基因型有两条电泳带(525bp、220bp)，

琼脂糖电泳,基因,基因型频率,遗传平衡

29图 1-2 VDR基因4个SNPS的PCR-RFLP琼脂糖电泳结果Figure 1-2 The AGE result of PCR-RFLP product of VDR gene3.3 遗传平衡检验根据群体遗传学的原理，只有符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡规体之间才具有可比性[44]。为了检验所研究样本的 VDR 基因型频率是群体代表性，对调查对象的基因型频率进行了 Hardy-Weinberg 平衡结果表明，所有检测样本基因型的观察值与期望值差异无显著性(P>

琼脂糖凝胶电泳

处有最大吸收峰，因此，可以用 260nm 波长光测定 RNA 浓度。1 个 OD 的密度值相当于大约 40μg /ml 的单链 RNA，RNA 浓度(μg/m1)=OD260×稀释数×40/1000。RNA 纯度=OD260/OD280。若比值较低，说明有残余蛋白质存在比值太高，则提示 RNA 有降解。我们选用 OD260/OD280介于 1.8-2.1 的纯较好的 RNA 用于后续实验。3.1.2 RNA 的质量鉴定2％琼脂糖电泳结果观察到凝胶上有 28s、18s、5s 三条条带，28S 18S 条带清晰，且 28S 的亮度在 18S 的两倍以上，说明 RNA 纯度高并且没降解，可以认为我们抽提的 RNA 的质量是好的(图 2-1)。

【参考文献】