急性呼吸道感染儿童HBoV和HCoV-229E的实时荧光定量PCR检测及临床分析

发布时间：2020-07-18 03:48

【摘要】： 目的分别建立人类博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)、人类冠状病毒229E(Human Coronavirus 229E, HCoV-229E)的实时荧光定量PCR(real-time Fluorescent Quantitative PCR, FQ-PCR)检测方法,检测呼吸道感染患儿标本的HBoV、HCoV-229E,并探索其临床意义。方法分别根据HBoV NP1基因、HCoV-229E M基因的保守序列设计引物和Taqman探针,扩增NP1基因、M基因片段,并将其克隆到pGEMT-Easy载体上,构建质粒标准品;建立FQ-PCR检测方法,建立标准曲线,进行敏感性、特异性、重复性试验;检测收集到的195例临床标本中HBoV、HCoV-229E的感染情况,同时用普通PCR检测这195例临床标本中的HBoV、HCoV-229E;将FQ-PCR结果与普通PCR结果进行比较分析。结果 1. FQ-PCR系统用于检测HBoV NP1基因,灵敏度为101copies/μl;对临床其他常见呼吸道病毒不出现特异性扩增曲线;批内变异系数为0.13%,批间变异系数为0.14%。 2.用FQ-PCR检测195例临床标本,共检出HBoV阳性12例(6.2%)。普通PCR检测结果与FQ-PCR检测结果一致。 3. 12例HBoV阳性标本中,患儿的年龄均为4岁以下,急性下呼吸道感染组阳性率为15.6%(10/64),显著高于急性上呼吸道感染组的1.5%(2/131)(X2=12.45,P0.005)。 4. FQ-PCR系统用于检测HCoV-229E M基因,灵敏度为101copies/μl;对临床其他常见呼吸道病毒不出现特异性扩增曲线;批内变异系数为0.4%,批间变异系数为0.7%。 5.用FQ-PCR检测195例临床标本,HCoV-229E阳性2例(1.0%)。普通PCR检测结果与FQ-PCR检测结果一致。 6.两例HCoV-229E阳性标本均为急性下呼吸道感染的患儿。结论 1.本研究建立的HBoV、HCoV-229E的FQ-PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性均较好,可用于临床呼吸道标本的检测以及HBoV与HCoV-229E的流行病学监测。 2.福州地区冬春季急性下呼吸道感染患儿中,存在HBoV、HCoV-229E感染。HBoV主要引起4岁以下婴幼儿的急性下呼吸道感染。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R725.6
【图文】：

电泳图,阳性对照,电泳图,重组质粒

M：100 bp DNA ladder ； 1：wide DNA ladder；1、2：HBoV NP1 基因阳性 PCR 产物 2：重组质粒 pGEMT-Easy-NP1 酶切结果图 1 HBoV 阳性对照扩增产物电泳图图 2 重组质粒 pGEMT-Easy-NP1 酶切电图 3 重组质粒 pGEMT-Easy-NP1 的部分序列图三、重组质粒的定量重组质粒的浓度（拷贝/μl）计算。将提取的重组质粒 DNA，用 GeneQuant Pro 仪测定，重组质粒pGEMT-Easy-NP1 的浓度为 72.6μg/ml。通过下述公式将重组质粒浓度单μg/ml 转换成 copies/μl，72.6μg/ml 经换算后为 2.17×1010copies/μl。

电泳图,重组质粒,酶切电泳

标准曲线,部分序列,重组质粒,浓度

图 3 重组质粒 pGEMT-Easy-NP1 的部分序列图三、重组质粒的定量重组质粒的浓度（拷贝/μl）计算。将提取的重组质粒 DNA，用 GeneQuant Pro 仪测定，重组质粒pGEMT-Easy-NP1 的浓度为 72.6μg/ml。通过下述公式将重组质粒浓度单位由μg/ml 转换成 copies/μl，72.6μg/ml 经换算后为 2.17×1010copies/μl。质粒 DNA 浓度＝质粒 DNA 浓度（μg/ml）× 6.2×1023(copies/μl) 660g/mol×碱基对数四、标准曲线重组质粒pGEMT-Easy-NP1依次稀释成107、106、105、104copies/μl浓度梯度，在ABI7300扩增仪上进行扩增，得到标准曲线Y= 3.50X+34.02（其中Y对应Ct值，X为标本拷贝数，图4）。

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