新生儿HCMV先天性感染与T淋巴细胞亚群变化的相关性研究

发布时间：2020-07-22 22:18

【摘要】：目的采集正常产妇脐血进行HCMV系列实验室检测,分析正常产妇分娩新生儿的HCMV先天性感染率。同时应用流式细胞术检测正常产妇脐血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分比,并计算CD4+"CD8+的比值,探讨HCMV先天性感染与T淋巴细胞亚群变化的相关性,进一步结合追踪患儿的临床表现,为HCMV先天性感染的有效预防和免疫治疗及临床妊娠干预提供科学依据。方法自2009年12月～2011年3月于合肥市妇幼保健院采集正常产妇36例脐血标本,按实验设计分别作如下处理:(1) HCMV病毒分离:取2ml脐血抗凝血,分离白细胞后接种到人胚肺成纤维细胞(HELF)培养物上,逐日于倒置显微镜下观察HCMV致细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE);(2)从分离的脐血白细胞中提取总DNA分别进行巢式PCR法和荧光定量PCR法检测;(3)将分离的脐血白细胞进行HCMV-pp65抗原血症检测;(4)从36例脐血标本中分别取0.5ml脐血,采用流式细胞术检测脐血中T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的百分比,并计算CD4+"CD8+的比值,结合追踪患儿的临床表现,分析新生儿HCMV先天性感染与T淋巴细胞亚群变化的相关性;(5)将巢式PCR扩增后的阳性标本测序,并与基因数据库序列比对,进一步证实巢式PCR扩增产物是HCMV gB基因。结果(1)病毒分离:分别将36份脐血白细胞接种于HELF细胞培养物上,盲传三代有5份标本出现HCMV特征性CPE,病毒分离率为13.9%(5"36);(2) HCMV-pp65抗原血症检测有6份为阳性,阳性率为16.7%(6"36),与病毒分离一致率为97.2%,其中共同阳性一致率为83.3%;(3)巢式PCR法检测结果:将36份脐血标本中提取的DNA分别进行HCMV UL55基因巢式PCR扩增, HCMV UL55 DNA的阳性率为22.2%(7"36),与病毒分离一致率为94.4%,其中共同阳性一致率为71.4%;(4)荧光定量PCR检测结果:将36份脐血标本中提取的DNA分别取2μl进行荧光定量PCR扩增,根据试剂盒规定的阳性结果判定标准,荧光定量PCR法检测HCMV-DNA的阳性率为30.6%(11"36),与病毒分离一致率为83.3%,其中共同阳性一致率为45.5%;(5)巢式PCR扩增产物的测序结果:巢式PCR阳性标本测序结果与设计的序列相一致,并与基因数据库序列比对,证明为HCMV gB2型。(6)流式细胞术检测T淋巴细胞亚群变化的结果:脐血标本中荧光定量PCR阳性组与荧光定量PCR阴性组CD_3~+淋巴细胞含量分别为(73.11±8.88)%和(71.66±8.59)%,差异无统计学意义(P㧐0.05);荧光定量PCR阳性组与荧光定量PCR阴性组CD_4~+淋巴细胞含量分别为(47.52±8.53)%和(52.476±7.25)%,差异无统计学意义(P㧐0.05),但荧光定量PCR阳性组CD_4~+淋巴细胞含量与荧光定量PCR阴性组相比较,有下降趋势;荧光定量PCR阳性组与荧光定量PCR阴性组CD_8~+淋巴细胞含量分别为(25.84±4.75)%和(18.07±4.06)%,荧光定量PCR阳性组CD_8~+淋巴细胞含量高于荧光定量PCR阴性组且差异有统计学意义(P㩳0.01);荧光定量PCR阳性组与荧光定量PCR阴性组CD_4~+"CD_8~+比值分别为1.89±0.45和3.026±0.75,荧光定量PCR阳性组CD_4~+"CD_8~+比值低于荧光定量PCR阴性组且差异有统计学意义(P㩳0.01)。(7)结合新生儿临床出生资料发现,有一例HCMV先天性活动性感染新生儿表现为宫内发育迟缓,其HCMV病毒分离、HCMV-pp65抗原血症检测、HCMV UL55基因巢式PCR检测和HCMV-DNA荧光定量PCR检测均为阳性,CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞含量分别为66.4%、36.2%、29.5%,CD_4~+"CD_8~+比值为1.21。结论(1)根据病毒分离结果作为“金标准”,初步确认判定HCMV先天性活动性感染的指标是:经测序证实的PCR检测HCMV IE、UL83基因阳性和巢式PCR检测UL55基因阳性及HCMV-pp65抗原血症阳性者。(2)通过对36份正常产妇脐血标本进行病毒分离、HCMV-pp65抗原血症检测、HCMV UL55基因巢式PCR检测和HCMV-DNA荧光定量PCR检测,并比较,本次研究中正常产妇分娩的新生儿HCMV先天性感染率为30.6% ,其中,HCMV先天性活动性感染率为16.7%。(3)利用流式细胞术测定36份脐血标本中T淋巴细胞亚群CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+的百分比,并计算CD_4~+"CD_8~+的比值。发现荧光定量PCR阳性组CD_4~+淋巴细胞含量与荧光定量PCR阴性组相比较,有下降趋势;荧光定量PCR阳性组CD_8~+淋巴细胞含量高于荧光定量PCR阴性组且差异有统计学意义(P㩳0.01);荧光定量PCR阳性组CD_4~+"CD_8~+比值低于荧光定量PCR阴性组且差异有统计学意义(P㩳0.01)。并且发现一例HCMV先天性活动性感染的新生儿出生时体重下降。分析发现,该新生儿的检测结果符合先天性活动性感染的判定指标,并且有CD_8~+淋巴细胞的百分比升高,CD_4~+"CD_8~+比值下降,提示机体的细胞免疫功能降低,表明HCMV先天性活动性感染与脐血T淋巴细胞亚群即机体细胞免疫应答状态的改变密切相关。 (4) 36例被检测新生儿中有一例新生儿出生时体重仅2.2千克,符合宫内发育迟缓的诊断标准。表明迫切需要尽快建立随访档案,定期对HCMV先天性活动性感染的新生儿上门体检。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R722.1
【图文】：

脐血,标本,直接免疫荧光,病毒分离

图 1 脐血标本病毒分离结果（未染色，×100）A：正常 HELF 细胞 B：HCMV 阳性标本出现 CPE3.2 HCMV pp65 抗原血症检测结果直接免疫荧光(FA)检测 36 份脐血标本中的 HCMV pp65 抗原，其中 6 份标本为阳性，阳性率为16.7%，与病毒分离一致率为97.2%，其中共同阳性一致率为83.3%结果见图 2。

直接免疫荧光,染料,蓝色,脐血

图２ HCMV pp65 抗原血症检测结果Ａ是阳性对照，在荧光显微镜下可见细胞核被 DAPI 染料染成均一的蓝色接免疫荧光检测可见绿色的荧光信号，Ｂ是 HCMV-pp65 抗原血症阳性的脐血标细胞核被 DAPI 染料染成均一的蓝色，直接免疫荧光检测可见部分细胞呈绿色信号；Ｃ是阴性对照，细胞核被 DAPI 染料染成均一的蓝色，直接免疫荧光检见绿色阳性信号。3.3 巢式 PCR 检测结果将 36 份脐血标本中提取的 DNA 分别进行巢式 PCR 扩增，然后分别取 6μPCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果见图 3。

动力学曲线,荧光定量PCR,动力学曲线

基因数据库序列比对，证明为 HCMV gB2型。3.5 荧光定量 PCR 检测结果严格按照试剂盒操作流程，将 36 份脐血标本中提取的 DNA 分别取 2μl 进行荧光定量 PCR 扩增，其扩增的标准曲线及阳性动力学曲线见图 4 和图 5。图 4 HCMV-DNA 荧光定量 PCR 标准曲线循环数

【参考文献】