【摘要】：第一部分cTnIR193H突变致限制性心肌病小鼠钙调节基因和蛋白表达异常目的:心肌肌钙蛋白I(cTnI)R193H基因突变可致限制性心肌病(RCM),心肌细胞对钙敏感性增高是RCM心肌舒张功能障碍的关键因素,但其机理不明。磷酸二酯酶(PDE)是调控心肌细胞对钙敏感性的重要因子,其能够水解细胞内cAMP的功能,影响PKA及其下游诸多钙调蛋白,从而直接影响心肌细胞对钙的敏感性。本部分研究将阐明cTnIR193H突变RCM小鼠心肌中,PDE及cAMP、PKA等钙调节基因和蛋白的表达情况。方法:(1)通过cTnI-knockout C57小鼠及cTnIR193H(193)RCM小鼠杂交产生cTnIR193H+cTnI-knockout(193+KO)RCM小鼠。以野生型C57小鼠、193小鼠、193+KO小鼠为研究对象,193+KO小鼠由于cTnIR193H突变蛋白更多,因此RCM相关症状比193小鼠更重。与通过高频超声检测各组小鼠心率。(2)通过q-PCR技术及western blot技术检测各组小鼠心肌PDE4D基因和蛋白的表达,PKA相关钙调节基因的表达,以及PKA、Ryr2磷酸化水平的检测。通过Ellisa技术检测各组小鼠心肌组织cAMP的水平。(3)以原代心肌细胞为研究对象,分为空转组,PDE4D低表达组和cTnIR193H过表达组。利用cytation5仪器观察PDE4D低表达心肌细胞和过表达cTnIR193H的心肌细胞搏动速率。结果:(1)与野生型C57小鼠相比,193小鼠及193+KO小鼠心率增快(p0.05)。(2)193+KO小鼠钙调节基因PKAcα、PKAcβ、Ryr2表达显著高于野生组(p0.05),而PDE基因亚型PDE1B和PDE4D均较野生组显著降低,且PDE4D降低更明显(p0.05)。193+KO小鼠心肌PDE4D蛋白水平降低(p0.05),PKA和Ryr2蛋白磷酸化水平较野生组显著升高(p0.05)。(3)193+KO小鼠心肌组织cAMP水平较野生组明显升高(p0.05)。(4)过表达cTnIR193H的原代心肌细胞与PDE4D低表达的心肌原代细胞较对照组均出现了搏动加快(p0.05)。结论:cTnIR193H突变RCM小鼠PKA信号通路活化引起心率增快可能与PDE4D低表达相关。第二部分组蛋白乙酰化修饰参与cTnIR193H限制性心肌病小鼠PDE4D低表达的调控目的:第一部分研究发现,cTnIR193H突变RCM小鼠PDE4D低表达可能是引起PKA相关钙调节基因改变的主要原因。但PDE4D低表达机制并不清楚。组蛋白修饰是表观遗传学常见的调控机制之一,有研究显示PDE受组蛋白修饰调控。本部分将以cTnIR193H突变RCM小鼠为研究对象,初步探讨RCM小鼠心肌PDE4D低表达的组蛋白修饰调控机理。方法:(1)研究对象及分组为野生鼠,193和193+KO鼠。通过Ch IP技术检测各组小鼠心肌中PDE4D基因启动子区域组蛋白乙酰化及甲基化水平。(2)q PCR检测各种组蛋白乙酰化酶、去乙酰化酶、甲基化酶的基因表达水平。(3)通过Co IP实验,筛选可以与cTnI相互作用的组蛋白修饰酶。(4)通过Ch IP技术检测各组小鼠心肌中PDE4D基因启动子区域HDAC1和SMYD1的结合水平。结果:(1)与野生组相比,193+KO小鼠PDE4D启动子区域H3K4、H3K9乙酰化水平以及H3K4三甲基化水平明显降低,差异具有统计学意义(p0.05)。(2)与野生组相比,组蛋白去乙酰化酶HDAC8和HDAC9 m RNA在193+KO小鼠中表达增加(p0.05),HDAC3 m RNA表达降低(p0.05),HDAC1和HDAC2 m RNA表达组间无差异(p0.05),组蛋白乙酰化酶GCN5及组蛋白甲基化酶SMYD1 m RNA在193+KO小鼠中表达增加,差异具有统计学意义(p0.05)。(3)Co IP显示HDAC1阳性。(4)与野生组相比,193+KO小鼠PDE4D基因启动子区域,组蛋白去乙酰化酶HDAC1和组蛋白甲基化酶SMYD1的结合水平均增加(p0.05)。结论:(1)193+KO小鼠心肌组织PDE4D的降低,可能由HDAC1介导的组蛋白H3K4和H3K9乙酰化修饰调控。(2)cTnIR193H突变蛋白可能通过与HDAC1蛋白互作从而调控PDE4D的表达。第三部分cTnIR193H通过HDAC1介导组蛋白乙酰化修饰调控PDE4D低表达目的:第二部分研究提示PDE4D的低表达可能与HDAC1介导的组蛋白乙酰化修饰相关。作为RCM发病的始发因素,cTnI可与HDAC1相互作用。那么,cTnIR193H突变是否通过HDAC1介导,调控PDE4D的低表达?本部分研究将在进一步验证HDAC1调控PDE4D的基础上,阐明cTnIR193H调控PDE4D的内在机理。方法:(1)以原代心肌细胞为研究对象分为空转组(NC),过表达HDAC1组(AV-HDAC1),过表达cTnI组(AV-cTnI)及过表达cTnIR193H组(AV-cTnIR193H),通过q PCR和WB检测PDE4D基因和蛋白的表达。(2)通过Ch IP,检测PDE4D基因启动子区域cTnI、cTnIR193H、HDAC1结合水平及H3K4、H3K9乙酰化水平。(3)通过免疫荧光技术,证明cTnI入核。通过WB比较cTnI和cTnIR193H的入核能力。(4)通过Co IP技术,比较cTnI和cTnIR193H与HDAC1的结合能力。(5)以293A细胞为研究对象,分为空载组,cTnI组及cTnIR193H组。通过荧光酶素报告实验,检测cTnI和cTnIR193H对PDE4D启动子区域的转录活性。结果:(1)与NC组比较,HDAC1过表达组PDE4D蛋白水平明显降低(p0.05),PDE4D基因启动子区域HDAC1的结合水平显著增加,H3K4和H3K9乙酰化的水平显著降低,差异具有统计学意义(p0.05)。(2)心肌细胞核可观察到cTnI入核,且核内cTnI和cTnIR193H的量无明显差异(p0.05)。(3)与空转组比较,cTnI对PDE4D启动子上游2000bp的荧光值增加(p0.05)。而cTnIR193H对PDE4D启动子上游2000b的荧光值没有明显的改变(p0.05)。(4)与空转组比较,过表达cTnIR193H后PDE4D基因和蛋白的表达显著降低(p0.05)。过表达cTnI后PDE4D m RNA水平明显增加(p0.05),但蛋白水平没有明显改变(p0.05)。(5)cTnI和cTnIR193H均能结合PDE4D启动子区域,且相对结合量无明显差别(p0.05)。与cTnI组相比,cTnIR193H组PDE4D启动子区域HDAC1结合水平明显增加,且H3K4、H3K9乙酰化水平显著降低(p0.05)。(6)与cTnI相比,cTnIR193H结合HDAC1的量明显增高,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:cTnIR193H突变通过与HDAC1相互作用,增加PDE4D启动子区域HDAC1结合水平,降低ac H3K4和ac H3K9的水平,从而抑制PDE4D基因和蛋白的表达。第四部分EGCG抑制cTnIR193H与HDAC1结合而改善cTnIR193H突变致PDE4D低表达目的:第三部分研究提示HDAC1介导cTnIR193H调控PDE4D低表达。我们前期研究发现EGCG可抑制HDAC1介导的组蛋白乙酰化修饰从而提高基因的表达,且EGCG对cTnIR193H限制性心肌病小鼠心功能有明显的改善作用。因此本部分选择EGCG作为干预剂,明确EGCG对cTnIR193H突变致PDE4D低表达的改善作用,并探讨其内在机理。方法:(1)以原代心肌细胞为研究对象,分为空转组、cTnIR193H组和cTnIR193H+EGCG干预组,通过q-PCR和WB技术检测PDE4D基因和蛋白的表达。(2)通过Ch IP技术检测各组PDE4D启动子区域HDAC1结合水平和cTnIR193H结合水平。(3)通过Co IP技术,检测EGCG对cTnIR193H和HDAC1结合力的影响,以及EGCG对HDAC1活性的影响。结果:(1)与对照组相比,cTnIR193H组PDE4D基因和蛋白水平降低(p0.05),EGCG干预后,PDE4D表达水平较cTnIR193H组显著增加(p0.05)。(2)与对照组相比,cTnIR193H组PDE4D启动子区域HDAC1结合量增加(p0.05)。EGCG干预后cTnIR193H组PDE4D启动子区域cTnIR193H和HDAC1结合水平显著降低(p0.05),ac H3K4及ac H3K9水平显著增加(p0.05)。(3)与cTnIR193H组比较,EGCG干预后cTnIR193H与HDAC1的结合量明显降低,差异具有统计学意义(p0.05)。(3)各组HDAC1的活性没有明显的改变(p0.05)。结论:EGCG通过抑制PDE4D启动子区域cTnIR193H与HDAC1结合而改善cTnIR193H突变致PDE4D低表达。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.4
【图文】：
图 1.2 PKA 钙调节相关基因的表达 n=6，*表示 p<0.05，与 WT 组比较Fig.1.2. Expression of genes associated with PKAn=6, * means p<0.05 vs WT group.表 1.1 PKA 钙调节相关基因的表达 n=6，*表示 p<0.05，与 WT 组比较Tab.1.1 Expression of genes associated with beta adrenergic activity n=6, * means p<0.05 vsWT group.基因 WT 193 193+KOADRB1 1.000±0.000 1.130±0.339 0.645±0.329*ADRB2 1.000±0.000 1.029±0.330 1.050±0.200PKAcα 1.000±0.000 1.250±0.621 4.110±1.254*PKAcβ 1.000±0.000 1.616±0.688 3.530±1.072*Ryr2 1.000±0.000 1.629±0.486 2.581±0.985*
图 1.3 PKA 及 Ryr2 蛋白磷酸化水平 n=6，*表示 p<0.05，与 WT 组比较Fig.1.3. Phosphorylation level of PKA and Ryr2 n=6, * means p<0.05 vs WT group.表 1.2 PKA 及 Ryr2 蛋白磷酸化水平 n=6，*表示 p<0.05，与 WT 组比较Table.1.2. Phosphorylation level of PKA and Ryr2 n=6, * means p<0.05 vs WT group.蛋白名称 WT 193 193+KOp-PKA 1.000±0.000 0.841±0.061 1.540±0.150*p-Ryr2 1.000±0.000 0.965±0.158 1.941±0.138*ELISA 结果显示，与 WT 组相比较，193+KO 组小鼠心肌中 cAMP 水平明显
图 1.4 各组小鼠心肌中 cAMP 含量 n=6，*表示 p<0.05，与 WT 组比较Fig.1.4. The level of cAMP among groups. n=6, * means p<0.05 vs WT group.表 1.3 各组小鼠心肌中 cAMP 含量 n=6，*表示 p<0.05，与 WT 组比较Table.1.3. level of cAMP. n=6, * means p<0.05 vs WT group.WT 193 193+KOcAMP 112.561±84.320 70.634±37.749 214.078 ±119.232*2.3 cTnIR193H 突变 RCM 小鼠心肌中 PDE4D 的表达如图 1.5A 所示，与对照组相比，在心脏中表达的 PDE1B,1C,2A,3A 和 4D 中，PDE1B 和 PDE4D 在 193+KO 组中表达显著降低，差异既有统计学意义（p＜0.05）。
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