调节性、效应性T细胞和树突状细胞在胆道闭锁患儿免疫炎症发展中的作用

发布时间：2020-08-03 17:47

【摘要】：研究目的: 研究CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞(Treg)、效应性Th17细胞(Th17)、树突状细胞(DC)及Toll样受体(TLR)在胆道闭锁(BA)患儿免疫炎症发展中的作用;并通过小鼠模型,观察通过注射IL-6中和抗体抑制Th17细胞分化对胆道闭锁发病的影响。研究方法: 收集32例胆道闭锁和18例对照组患儿(非胆道疾病)肝脏和外周血标本。实时定量逆转录PCR(Q-RT-PCR)及免疫组织化学方法检测肝脏组织Foxp3、IL-17、ROR-γt的mRNA及蛋白表达;流式细胞术检测外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞和Th17细胞占CD4~+T细胞比例;ELISA法检测血清中相关细胞因子IL-10、TGF-β、IL-17、IL-6、IFN-γ、IL-12的表达;分离外周血树突状细胞(DC),CD4~+T和CD8+T细胞,ELISA法检测细胞培养上清IL-6的表达变化;将T淋巴细胞和DC细胞混合培养,ELISA法检测培养上清中IL-17的表达;Q-RT-PCR,Western blot及免疫荧光检测DC细胞TLR3、7、8 mRNA及蛋白的表达。应用恒河猴轮状病毒(RRV)建立胆道闭锁小鼠模型,将新生Balb/c鼠随机分为正常对照组,病毒对照组和IL-6抗体组,正常对照组腹腔注射病毒培养液,即含2%胎牛血清的最低必须培养基(2% Fetal Cow Serum - Minimum Essential Medium,2%FCS-MEM),病毒对照组腹腔注射RRV,IL-6抗体组在腹腔注射RRV之后的24小时按注射剂量分4组注射IL-6中和抗体,分别为5μg,15μg,20μg,25μg,观察小鼠的临床表现及其组织病理学变化。应用实时定量荧光PCR (Q-RT-PCR)分别检测正常对照组,病毒对照组,IL-6抗体组小鼠出生4、7、10、14、21天肝脏Foxp3,IL-17,ROR-γt mRNA的表达;分离脾脏树突状细胞(DC),CD4+T和CD8+T细胞,ELISA法检测细胞培养上清IL-6的表达变化;将T淋巴细胞和DC细胞混合培养,ELISA法检测培养上清中IL-17的表达;Q-RT-PCR检测DC细胞TLR3、7、8 mRNA的表达。实验结果: 免疫组织化学显示BA组肝组织汇管区Treg和Th17细胞明显比对照组增多,肝脏Foxp3、ROR-γt,IL-17的mRNA及蛋白表达量也显著高于对照组患儿,P0.05。BA组中血清TGF-β、IL-10(Treg相关因子)、IL-17(Th17相关因子)、IL-12、IFN-γ(Th1相关因子)和IL-6均显著高于对照组,P0.05,差异有统计学意义。其中IL-6升高24倍,最为明显。流式细胞学检查显示外周血Th17/CD4~+T比例显著高于对照组,P0.05;Treg/CD4+T细胞比例无差异;而同一患者中Treg/Th17比例显著低于对照组,P0.05。体外细胞培养发现BA组DC细胞培养上清的IL-6明显增高;BA组PMBC+DC细胞+ TGF-β培养上清中IL-17表达增高(P0.05);DC细胞TLR3、7、8的表达显著高于对照组,P0.05。94只病毒对照组小鼠中64只小鼠发生BA (71.91%),出现发育迟缓(表现为体重增加缓慢、停滞)和胆汁淤积(表现为无毛区黄疸、尿色深黄、陶土样大便)症状。肝脏大体观可见明显黄染,表面呈颗粒状,肝外胆管呈索条状闭锁,胆囊显示不清,组织切片苏木素伊红染色(Hematoxylin-Eosin stain, HE)显示肝内外胆管闭锁;其中寿命达到或超过21d的小鼠仅4只(包括21天取材2只),比例为6.25%;无小鼠退黄(0%);193只IL-6抗体组小鼠中,5μg、15μg、20μg注射剂量组各48只,分别有34只(73.91%)、33只(70.21%)、29只(61.71%)出现上述表现,25μg注射剂量组49只,有25只(52.08%)小鼠出现上述表现,显著低于病毒对照组,P0.05;寿命超过或达到21d的BA小鼠2只,比例为9.52%;4只小鼠自然退黄,体重逐渐恢复,比例为16%,显著高于病毒对照组,P0.01;31只对照组小鼠观察至21天没有上述表现。病毒对照组小鼠肝组织内Foxp3,IL-17,ROR-γt mRNA表达在第7-10天显著高于正常组和25ug剂量的IL-6抗体组,P0.05。体外细胞培养发现病毒对照组小鼠DC细胞培养上清的IL-6明显增高,P0.05;病毒对照组小鼠T细胞+DC细胞+ TGF-β培养上清中IL-17表达增高,P0.05;DC细胞TLR3、7、8的表达显著高于对照组,P0.05。实验结论: 1. BA患儿中Th17细胞增多、IL-17水平增高而Treg细胞相对减少在BA的进行性免疫炎症中发挥重要作用。 2. BA中DC细胞通过TLRs识别病原微生物而活化,分泌大量IL-6,促进Th17细胞分化,而抑制Treg细胞分化,从而导致BA体内呈现过度免疫。 3.通过IL-6抗体抑制Th17细胞分化,可以达到降低BA发病率、延长BA患儿生存时间的目的。为治疗BA的进行性免疫炎症奠定了实验基础。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R726.5
【图文】：

免疫组织化学染色

20图 1 肝脏组织中 Foxp3、IL-17、ROR-γt 的免疫组织化学染色（200×）：A、C、BA 组 Foxp3、IL-17、ROR-γt 表达；B、D、F：C 组 Foxp3、IL-17、ROR-γt 的表

细胞图,流式,外周血,细胞

外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg和Th17细胞流式检测图

细胞图,共刺激分子,免疫荧光染色

2. BA组中DC细胞培养上清液中IL-6表达升高:第一部分中结果显示 BA 组血清中 IL-6 水平是对照组的 24 倍，分离培养外周血免疫细胞，选取 BA 肝脏汇管区显著增多的 CD4+、CD8+、DC 细胞进行体外培养。结果显示与对照组相比 DC 细胞培养上清中 IL-6 的表达上调最明显，P<0.001；而 CD4+T和 CD8+T 细胞的培养上清中，IL-6 的表达与对照组无显著差异 P>0.05（图 2）。图 1 免疫荧光染色显示成熟的 DCs 表达共刺激分子 CD80、CD86：上图蓝色为细胞核染色，红色为 CD80 染色，绿色为 CD86 染色，黄色为 CD80、CD86。其中双标阳性染色的细胞比例>85%。

【参考文献】