Ⅰ.1型糖尿病患儿NK细胞受体及其配体基因的初步研究 Ⅱ.A20转基因抑制胰岛移植排斥反应作用的初步探讨

发布时间：2020-08-15 07:56

【摘要】：第一部分 1型糖尿病患儿NK细胞受体及其配体基因的初步研究 目的及意义：目前已知自然杀伤(nature kill, NK)细胞在1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)的发生机制中发挥重要作用,杀伤细胞免疫球蛋白样受体(the killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)是NK细胞受体中极为重要的一类受体。某些KIR激活性基因和抑制性基因,可以单独的或联合它们的HLA-C配体,影响T1D的发生。本研究拟通过发现与T1D发病的相关基因型,研究KIR在T1D中的作用,进一步阐明T1D的发病机理,为NK细胞在临床上的应用奠定理论基础并提供新的策略和方式。 方法：本文在中国汉族人群中,采用T1D和对照组年龄、性别一对一匹配对照,研究KIR基因及其配体HLA-C基因与1型糖尿病发病的相互关系。选取明确诊断的1型糖尿病患者259例,平均发病年龄6.94±3.64岁,其中男性123名,女性136名,所有患者均是汉族。所有患者均符合2010年美国糖尿病协会糖尿病诊断标准,并除外2型糖尿病、特殊类型糖尿病等其他类型糖尿病。收集T1D患者性别、发病年龄、糖化血红蛋白、C肽、是否合并糖尿病酮症酸中毒、是否合并自身免疫性疾病,自身抗体检测结果等临床资料。在T1D组中,谷氨酸脱羧酶65片段(glutamic acid decarboxylase 65, GAD65)抗体资料齐全者128例,其中79例阳性。蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, IA2)抗体资料齐全者88例,其中59例阳性。 选取正常对照262例,也均为汉族,与T1D患者组为年龄、性别一对一匹配对照。所有对照组成员进行健康体检,无糖尿病、肝肾疾病、自身免疫性疾病等慢性疾病史,与T1D组无血缘关系。 采取以上患者和对照者血样,行KIR基因及其相应配体HLA-C基因检测。 结果：在1型糖尿病和正常对照中,KIR的基因型在两组中没有明显的差异。但在1型糖尿病组中,HLA-C1基因和HLA-C2基因(边缘相关)发生的频率较高。组合基因型2DL2-/HLA-C1+、2DL3+/HLA-C1+和2DS2-/HLAC1+与1型糖尿病呈正性相关。组合基因型2DL1+/HLA-C2-、2DL2-/HLA-C1-、2DL3+/HLA-C1-和2DS2-/HLAC1-与1型糖尿病呈负性相关。在我们检测的基因中,HLA-C1和C2的组合与1型糖尿病有非常明显的相关性,比HLA-C1单独出现的相关性更强。在GAD抗体阳性患者中,KIRs 2DL1、2DL2和2DL3以及HLA-C1的频率较高；在IA-2抗体阳性的患者中,KIRs 2DS4出现的频率较高。但KIR/HLA-C和抗体的相关性经Bonferroni校正后,无统计学差异。 结论：在我们的研究中,1型糖尿病与KIR基因型无直接的相关性,但是在1型糖尿病中KIR基因型与不同的HLA-C1和C2组合却显示出明显的差异,各种KIR基因及其配体HLA-C的类型与1型糖尿病之间有不同的正性或负性的相关性。提示1型糖尿病的发生可能与KIR及其HLA-C失衡有关。 第二部分 A20转基因抑制胰岛移植排斥反应作用的初步探讨 目的及意义：通过在体内重建内源性胰岛素分泌系统,从根本上治愈糖尿病已逐渐成为共识。胰岛移植是在体内重建内源性胰岛素分泌系统最安全、有效的方法之一。异种胰岛移植可提供更丰富的供体胰岛来源,但同时面临的重大问题就是免疫排斥反应。随着基因工程技术的不断发展,基因治疗技术的出现为最终解决移植免疫排斥问题提供了可能性。由于A20具有抑制TNF诱导的细胞凋亡和抑制NF-κB活性的双重功能,本研究通过携带A20基因的重组慢病毒转染小鼠胰岛细胞,并植入糖尿病大鼠肾包膜下,建立鼠类异种胰岛移植模型。研究A20基因在抑制鼠类异种胰岛移植排斥反应和保护胰腺β细胞免受细胞因子诱导的凋亡中的作用,为基因转染胰岛细胞移植的临床应用奠定基础。 方法：分离培养胰岛细胞采用胶原酶消化法,消化分离C57BL/6J小鼠的胰腺组织,用“两次过筛法”纯化出胰岛细胞。纯化的胰岛细胞悬浮于含胎牛血清的DMEM培养基中,培养28h后的细胞转染人A20慢病毒(lenti-A20)重组质粒。用AO/PI荧光染色法鉴定胰岛细胞的活性,双硫腙(dithizone, DTZ)染色法鉴定纯化胰岛的纯度。同时,用腹腔一次注射STZ给药的方法建立糖尿病SD大鼠模型,然后建立鼠类异种基因胰岛细胞移植模型(C57BL/6J小鼠→患病的SD大鼠),以肾包膜下注射的方法实施胰岛移植,分别将已制备的A20基因修饰的胰岛细胞、未经处理的胰岛细胞和PBS移植给T1D大鼠,监测移植后受体鼠血糖的浓度变化,同时测定胰岛素分泌情况。在第3d取胰岛细胞移植后受体鼠肾脏做免疫组化染色检查。 结果：采用胶原酶灌注和两次过筛获得的胰岛纯度为90-100%,分离纯化后的胰岛细胞活率95%。胰岛细胞具有良好的形态,在倒置显微镜下呈圆形或卵圆形,大小不一,散在分布或成簇。基因转染后胰岛细胞的形态及活性无明显变化。与对照组相比,A20基因修饰的胰岛细胞移植组鼠在移植后糖尿病症状缓解；血糖水平于移植后第2天开始下降至正常水平,并持续时间较长；胰岛移植物存活时间(6±3d)较对照组(3±1d)有明显延长(P0.05)。移植后测定胰岛素水平,数据显示转染A20基因胰岛细胞的移植组受体鼠的胰岛素分泌水平升高,说明该胰岛细胞因成功诱导受体鼠的免疫耐受而得以存活。而无A20移植组受体鼠的胰岛素水平下降较早,说明移植胰岛已被免疫排斥而破坏。 结论：A20基因的重组质粒转染能显著延长移植胰岛的存活期,明显改善受体鼠糖尿病症状,有效控制血糖水平,为改善1型糖尿病的胰岛移植治疗效果提供了新的途径。A20基因抑制免疫排斥反应和抗p细胞凋亡的双重功效使之在胰岛细胞移植,尤其是异种胰岛移植领域中,将发挥着重要的免疫调节作用。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R725.8
【图文】：

在移植后第3d和移植失败后行受体肾脏免疫组织化学染色检查。在肾被膜下可观察到:移植后3d血糖正常时，可以找到胰岛细胞团;而当移植失败，血糖明显升高时，未能找到胰岛细胞(图3)。图3肾被膜下胰岛细胞移植术后的免疫组织化学染色A:移植后3d血糖正常时，仍可找到胰岛细胞团B:移植失败，血糖明显升高时，未见胰岛细胞

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本文编号：2793833