早期宫内感染对肺发育的影响及可能机制

发布时间：2020-08-19 15:48

【摘要】： 目的： 随着机械通气和肺泡表面活性物质、激素等的应用及新生儿重症监护技术的发展,早产儿和极低体重儿的存活率明显提高,早产儿肺部疾病的发病率也随之增加。宫内感染是影响肺正常发育的重要因素,宫内感染可以引起肺部炎症反应,增加肺表面活性物质蛋白(surfactant protein, SP)的表达,促进肺成熟,降低新生儿呼吸窘迫综合症(respiratory distress syndrome, RDS)的发生。宫内感染也是支气管肺发育不良(bronchopulmonary disease, BPD)发生的重要原因之一。既往认为BPD是长期的机械通气、高浓度氧疗所致,而新型BPD的肺泡和气道损伤、纤维化较轻,以炎症导致的肺泡和肺微血管发育不良为主要特征。目前宫内感染在肺发育过程中的作用机制尚不十分明确,可能从以下几方面影响肺发育：1.细胞因子介导的炎症反应：宫内感染产生大量炎症因子如白细胞介素(interieukin, IL)-1β,IL-6,IL-8及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a等,引起肺局部炎症、促进肺部成熟；也可以导致肺发育受损。2.影响肺血管的发育：宫内感染可能通过下调与肺血管发生形成相关的生长因子,从而影响肺微血管的发育,阻碍肺泡化进程,促进支气管肺发育不良的发生。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在肺组织内表达丰富,可以通过与内皮细胞上的受体fms-样酪氨酸激酶(fms-like tyrosine kinase, Flt-1)和胎肝激酶1(fetal liver kinase-1,Flk-1)结合发挥多种生物学功能,是传递内皮细胞有丝分裂信号,促进内皮细胞分裂、增殖、分化,诱导肺血管发生的重要因子。3.早产：宫内感染是导致早产的主要原因之一。早产儿肺发育仍处于小管期或者囊状期,肺形态和功能都尚未成熟,外界刺激可引起肺发育停滞；而早产儿出生后更易暴露于机械通气、高氧、气压伤、感染等不利因素中,可进一步触发肺部炎性因子瀑布反应,加重气道、肺血管及间质损伤,导致BPD的发生。 目前在关于宫内感染对肺发育影响及其机制的研究中,多数使用内毒素／脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)注射来建立感染模型,且研究时间多于孕后期(小管期以后),尤其以囊状期到肺泡期为最多,而对于肺发育早期(假腺期)宫内感染后的肺发育变化研究的仍较少。由于建立宫内感染模型时的胎龄不同、方式不同或动物品种的不同,研究者报道宫内感染对肺发育的影响也不同。假腺期是肺发育过程中一个重要的时期。在假腺期内,肺内气道血管迅速分支；到假腺期末,肺导气部气道及伴行血管基本形成。因此,本研究选择在假腺期,通过宫颈内注射大肠杆菌液的方式建立宫内感染模型,评价肺发育早期宫内感染后胎鼠和新生大鼠体重、肺重、肺泡数目及结构变化、肺表面活性物质蛋白的表达；观察TNF-α、IL-1β、VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的表达,从而来探讨肺发育早期的宫内感染对肺发育的影响及可能机制,为早产儿支气管肺发育不良等疾病的防治提供新的思路。 方法： 1.实验分组：对照组和宫内感染组,每组各22只大鼠。对照组为孕龄15天的大鼠左右两侧宫颈内各注射生理盐水0.2 mL,宫内感染组为孕龄15天的大鼠左右两侧宫颈内各注射大肠杆菌稀释液0.2 mL。 2.标本收集：分别按照宫内感染后24小时及17、19、21日胎龄,将剖宫产获得的胎鼠处死,收集胎肺组织；对自然分娩的新生大鼠按照1、3、7、14日龄4个时间点进行肺组织的收集,进行灌注后迅速取出肺组织,将肺组织放于中性甲醛固定、石蜡包埋,或将肺组织经液氮速冻后放至-80℃冰箱中保存。 3.实验方法：检测两组中胎鼠和新生大鼠的体重、肺重、肺重／体重；应用苏木素-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色观察两组中17、19、21日胎龄和新生1、3、7、14日龄大鼠肺组织的病理变化特点；辐射状肺泡计数(radical alveolar counts,RAC),自呼吸性细支气管中心到最近纤维膈或胸膜的垂直线上的肺泡数；免疫组化染色检测两组中17、19、21日胎龄和新生1、3、7、14日龄大鼠肺组织中SP-A、Flt-1和Flk-1的表达；Western blot法检测两组中17、19、21日胎龄和新生1、3、7、14日龄大鼠肺组织中VEGF的蛋白水平；荧光定量RT-PCR检测两组中17、19、21日胎龄和新生1、3、7、14日龄大鼠肺组织内炎症因子(TNF-α和IL-1β),肺表面活性物质蛋白(SP-A和SP-B),和VEGF、Flt-1、Flk-1mRNA的表达。 结果： 1.44只孕鼠活动、进食均正常,无1例发生死亡。孕鼠分娩情况：对照组共获158(158／161)只胎鼠和50(50／52)只新生大鼠,宫内感染组共获145(145／149)只胎鼠和55(55／60)只新生大鼠。宫内大肠杆菌感染的孕鼠子宫壁及胎盘内血管充血、水肿,并见大量中性粒细胞浸润。对照组的孕鼠子宫及病理检测均未见明显的炎症反应。 2.假腺期宫内感染后,17、19、21日胎龄和新生1日龄的大鼠体重明显降低；17、19、21日胎龄和新生1、3日龄的大鼠肺重明显降低；17、19日胎龄的胎鼠肺重／体重比值明显降低。 3.肺组织HE染色可见：19日胎龄的胎肺组织中,宫内感染组的囊状样结构少于对照组；宫内感染组7日龄的新生大鼠肺组织中,肺泡膈少于对照组,肺泡数目减少,肺泡结构简单化；宫内感染组14日龄新生大鼠肺组织中,肺泡数目减少,肺泡膈厚度增厚；宫内感染组新生7、14日龄的大鼠肺组织RAC均明显减少；两组胎鼠和新生大鼠的肺组织内均未见明显肺实质纤维化病变。 4.宫内感染后24小时及17、19、21日胎龄的胎肺组织内的TNF-α, IL-1βmRNA表达,与对照组比没有显著差异；宫内感染组新生1、3、7日龄大鼠肺组织内TNF-αmRNA的表达水平显著升高；宫内感染组新生1、7、14日龄大鼠肺组织内的IL-1βmRNA的表达水平显著升高。 5.宫内感染组17、19、21日胎龄的胎肺组织内SP-A mRNA表达降低,19日胎龄的胎肺内SP-A的蛋白水平降低；宫内感染组19、21日胎龄的胎肺及新生7日龄大鼠肺组织内SP-B mRNA表达减少。 6.宫内感染组17、19日胎龄的胎肺内VEGF mRNA和蛋白表达水平降低,各时间点新生大鼠肺组织内VEGF蛋白表达在两组内无差异；宫内感染组Flt-1和Flk-1在胎肺内表达与对照组无明显差异,而新生7、14日龄大鼠肺组织内的Flt-1和1、7、14日龄大鼠肺组织内的Flk-1 mRNA较对照组明显的升高,免疫组化显示宫内感染组新生7日龄的大鼠肺组织内的Flk-1及Flt-1表达增多。 结论： 1.假腺期宫颈内接种大肠杆菌建立的宫内感染大鼠模型导致胎鼠体重、肺重及肺重／体重的降低；新生大鼠肺泡数目减少,肺泡膈减少、增厚,提示肺发育早期的宫内感染使肺泡发育受损,导致了类似于BPD的病理变化。 2.假腺期宫内大肠杆菌感染后胎肺组织内SP-A和SP-B表达显著下降,说明肺发育早期宫内感染抑制了胎肺中SP-A和SP-B的表达,不能促进胎肺的成熟。 3.假腺期宫内大肠杆菌感染后,细胞因子INF-αIL-1β在新生大鼠肺组织内表达增高,提示由宫内感染导致的细胞因子反应在肺发育受损的发生、发展中起着重要作用。 4.假腺期宫内大肠杆菌感染后,胎鼠和新生大鼠肺组织内的VEGF、Flt-1和Flk-1表达紊乱,提示VEGF及其受体在肺发育中可能起着重要作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R722.1
【图文】：

08060.2口口宫内感染组组圈圈对照组组鬓鬓鬓蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙蒙姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗姗IIIIIIIiiiiiiiii鹦鹦鹦鹦鹦鹦鹦鹦鹦El下E19EZIP1P3P，P14图LZ两组胎鼠和新生大鼠的肺重比较注:‘表示尸<0.05，**表示尸<0.01，均表示与对照组比较.

图1.4母鼠子宫的病理变化特点(HE染色:光镜x200)A图:宫内感染后母鼠子宫粘膜层及粘膜下层可见血管充血、水肿，大量中性粒细胞浸润;B图:对照组母鼠子官粘膜层及粘膜下层未见明显中性粒细胞浸润及血管充血水肿。

图1.4母鼠子宫的病理变化特点(HE染色:光镜x200)A图:宫内感染后母鼠子宫粘膜层及粘膜下层可见血管充血、水肿，大量中性粒细胞浸润;B图:对照组母鼠子官粘膜层及粘膜下层未见明显中性粒细胞浸润及血管充血水肿。

【共引文献】

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本文编号：2797271