自噬在SD乳鼠心肌细胞内毒素预适应中的作用研究

发布时间：2020-08-24 22:00

【摘要】：研究背景脓毒症是感染诱发的系统性失调控免疫反应,是儿童重症监护病房的常见危重病,在世界范围内是导致儿童死亡的主要原因之一。脓毒症心肌损伤的具体机制尚不明确。脓毒症发生时机体产生大量促炎调节因子,这些进入血液循环的促炎因子可对心肌造成炎性损伤。大量内毒素的释放是脓毒症的特征之一,内毒素可以对心肌组织造成直接损伤,使心肌组织出现的结构性改变以及心肌能量代谢障碍。自噬是细胞维持稳态的一种生理现象,在应激或损伤时会启动增强。内毒素也是诱导自噬启动的重要信号,一定强度的自噬被认为有利于减轻脓毒症状态下的组织损伤。预适应现象被证实存在于多种器官组织,研究证实心肌组织存在内毒素预适应,可以减轻缺血再灌注损伤;但能否诱导心肌细胞产生对内毒素的耐受能力尚不明确。研究目的探究心肌细胞内毒素预适应是否具有保护作用,以及自噬在心肌内毒素预适应过程中的影响。研究方法第一部分:健康新生SD乳鼠,分离心肌组织进行体外原代培养。随机分为六组:(1)空白对照组CON:全培养基培养20h;(2)预适应对照组PRE:1μg/ml LPS刺激4h,后换液为全培养基去除刺激至结束;(3)预适应1组PH5:1μg/ml LPS刺激4h,后换液去除刺激12h,再使用大剂量的5μg/mlLPS刺激4h;(4)大剂量对照1组H5:5μg/mlLPS刺激4h;(5)预适应2组PH50:1μg/mlLPS刺激4h,后换液去除刺激12h,再使用大剂量的50μg/ml LPS刺激4h;(6)大剂量对照2组H50:50μg/ml LPS刺激4h。第二部分:在第一部分基础上增加药物干预自噬的组别,雷帕霉素对照组RAPA:含雷帕霉素0.1μM/m 的全培养基孵育4h,后换液为全培养基去除刺激至结束。雷帕霉素组RH:含雷帕霉素0.1μM/ml的全培养基孵育4h,后换液去除刺激12h,再使用大剂量的5μg/mlLPS刺激4h。3-MA对照组PM:含1μg/ml LPS及5mM/ml 3-MA的全培养基孵育4h,后换液去除刺激至结束。3-甲基腺嘌呤组PMH:含1μg/ml LPS及5mM/ml3-MA的全培养基孵育4h,后换液为全培养基去除刺激12h,最后使用大剂量5μg/mlLPS刺激4h。结束后收取细胞和培养基,做后续IL-1β、TNF-α、LDH及LC3-Ⅱ检测。第三部分:去除预适应后的间歇期,设置梯度对照组P4:1μg/mlLPS刺激4h,后换液去除刺激4h,与梯度组同时收取细胞。梯度组P4H4:1μg/mlLPS刺激4h,后立即换液为大剂量5μg/ml内毒素LPS的全培养基刺激4h。结束干预后收取各组细胞和培养基,做后续IL-1β、TNF-α、LDH及LC3-Ⅱ检测。研究结果1.内毒素预适应上调了心肌细胞LC3-Ⅱ,相比于直接接触大剂量LPS可以减轻IL-1β、TNF-α的mRNA表达以及LDH的外漏。2.雷帕霉素预先诱导LC3-Ⅱ上调也可以减轻高浓度LPS引起的IL-1β、TNF-α高表达和LDH漏出,使用3-MA适度下调预适应后LC3-Ⅱ的表达量能进一步降低IL-1β、TNF-α的表达量和LDH漏出量。3.梯度升高LPS浓度也可以上调LC3-Ⅱ蛋白,可以减轻大剂量LPS造成的 IL-1β、TNF-α 和 LDH 升高。结论1.小剂量内毒素对心肌细胞做预适应处理后,可以在短期内提高心肌细胞对大剂量内毒素的抵抗性,一定程度上减轻损伤。2.内毒素预适应的保护机制和预先诱导心肌细胞增强自噬水平有关,其保护效果和自噬水平并非呈正相关,适度抑制自噬也能增强心肌细胞对内毒素的耐受能力。3.相比于单次接触大剂量内毒素刺激,去除预适应后间歇期而梯度升高内毒素浓度也可以有效减轻心肌细胞损伤。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R720.597
【图文】：

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【参考文献】

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本文编号：2802917