HBV特异性T细胞应答在长效干扰素alpha-2a治疗儿童慢性乙型肝炎中作用的研究

发布时间：2020-08-28 08:03

　　研究背景慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染损伤宿主免疫应答,致使宿主不能完全清除病毒,肝脏炎症病理持续存在并最终发展为肝硬化和原发性肝癌。在慢性HBV感染中,由于持续暴露于高浓度的HBV抗原之下,HBV特异性的T细胞(HBV-specific T cells)数量减少并且功能耗竭,这是导致HBV感染慢性化的主要原因。目前治疗慢性乙型肝炎(CHB)的长效干扰素α(PegIFNα)可通过激活宿主免疫应答抑制病毒复制,提高HBV e抗原(HBeAg)血清学转换率,并且停药后复发率较低。既往在成人CHB研究中发现PegIFNα能激发HBV特异性T细胞的抗病毒作用,但在儿童CHB中尚未研究。研究目的本研究以PegIFNα治疗HBeAg 阳性儿童CHB为对象,探讨PegIFNα治疗过程中T/NK细胞表型频数及HBV特异性T细胞细胞因子分泌功能的动态变化,并分析其与治疗结局的关系。研究方法1.研究对象以2015-2017年20例PegIFNα治疗HBeAg儿童CHB为对象。收集0,12,24,36,48周肝素钠抗凝外周血,根据治疗结局分为完全应答组(complete response,CR)和不应答病例组(non-response,NR)。CR组定义为HBV DNA,HBsAg和HBeAg三者转阴;NR组定义为HBV DNA,HBsAg和HBeAg三者下降程度均小于 1 log10 IU/mL 或 1 log10 COI。2.HBV病毒定量和血清学检测COBAS TaqMan HBV检测血清病毒定量,雅培i2000检测HBeAg和HBsAg。3.T/NK细胞表型检测Ficoll密度梯度离心法分离得外周血单个核细胞(PBMCs),流式细胞术检测 CR/NR 组 CD69+CD4+/CD8+T 细胞、TRAIL+CD4+/CD8+T 细胞和 TRAIL+CD56+NK细胞的频数。4.HBV特异性细胞应答检测以合成的HBV B基因型的core/envelope/X/CF肽库特异刺激PBMCs 10天,标记CD4+/CD8+T细胞表型后破膜胞内染色IFN-γ并以流式细胞术检测其频数。结果1.PegIFNα 显著降低患儿 HBV DNA、HBsAg、HBeAg 水平HBV DNA、HBsAg、HBeAg和ALT在未治疗患儿中均呈现较高水平(中位数分别为 HBV DNA 1.7E+08 IU/mL,HBsAg 23339.500 IU/mL,HBeAg 1260.690 COI,ALT 110.5 U/L);经过 PegIFNα 治疗后,HBV DNA、HBsAg、HBeAg可见显著下降(中位数分别为HBV DNA 10 IU/mL,HBsAg 0.92 IU/mL,HBeAg 2.17COI,ALT 69 U/L),均有显著差异(P0.01)。2.CR组CD69+/TRAIL+T细胞频数明显高于NR组经过PegIFNα治疗后,CR组CD69+CD8+T细胞频数显著高于NR组(1.82%vs.0.61%,P=0.0003);同样,TRAIL+CD4+T 和 TRAIL+CD8+T 细胞频数在CR 组也显著高于 NR 组(分别为 1.30%vs.0.19%,P=0.001,1.34%vs.0.34%,P=0.002)。3.CR组T/NK细胞表型随治疗的动态变化选取相邻时间log10 HBV DNA最大变化点(定义为MFC)作为纵向比较的时间点,MFC时间点的CD69+CD4+/CD8+T细胞频数显著高于基线(分别为1.19%vs.0.69%,P=0.01;2.45%vs.1.18%,P=0.003);MFC时间点 TRAIL+CD4+/CD8+T细胞频数同样显著高于基线(分别为2.81%vs.1.92%,P=0.009;2.75%vs.1.89%,P=0.002)。此外,与基线相比,MFC 时间点的 TRAIL+CD56hi NK细胞的频数显著升高(2.00%vs.0.92%,P=0.003)。并且,基线时的TRAIL+CD56hi NK细胞频数与基线的ALT水平呈正相关(r=0.663,P=0.002)。4.CR组HBV T细胞特异性应答水平显著高于NR组HBV特异性T细胞应答在CR组和NR组可检测到阳性结果。在基线时间点,CR组的core/envelope肽库特异性刺激的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞频数显著高于NR组(均值0.68%vs.0.26%,P=0.001);而在治疗结束时,两组HBV特异性T细胞应答水平的差异进一步增大。在CR组中,治疗结束时间点的core特异性的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞应答水平显著高于基线(0.67 vs.1.04,P=0.009;0.5 vs.0.91;P=0.041);基线core/envelope特异性的IFN-γ+CD4+/CD8+T频数分别与log 10 HBV DNA从基线到12 周的下降程度呈正相关(r=0.639,P=0.002;r=0.680,P=0.001)。结论在PegIFNα治疗儿童CHB中,早期增强的HBV特异性T细胞应答水平与治疗结局相关,强效的HBV特异性T细胞应答预示更易发生HBsAg转阴,最终可达到临床治愈。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.1
【图文】：

信号通路,经典,干扰素

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｃｌａｓｓｉｃａｌ邋ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ邋（ＩＦＮ）邋ａｎｄ邋ＩＦＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅ邋（ＩＳＧ）逡逑ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｔｏ邋ｖｉｒａｌ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑（图片来源：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ邋ｉｎ邋Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ邋（２０１８）邋１８；邋９：１６１１）逡逑于２周岁以上儿童，ＩＦＮｏｔ可考虑作为首选治疗［３７，３８］。丨ＦＮａ副作用包括发热、类逡逑流感症状、甲状腺功能亢进或减低、自身免疫疾病、行为异常、消化不良、白逡逑细胞减少以及生长发育迟缓，但这些副作用在停药后基本可自行消退［３＜Ｘ３＼逡逑长效干扰素目前尚未批准治疗儿童慢性乙型肝炎（已批准联合利巴韦林治逡逑疗儿童慢性丙型肝炎）。由于在干扰素分子上增加了聚乙二醇基团，长效干扰逡逑素更不易被分解，能维持体内较高水平的血药浓度，与普通干扰素相比注射间逡逑隔时间更长（一周…次）。并且在治疗成人慢性乙型肝炎的临床研究中发现，逡逑长效干扰素抗病毒效果优于普通干扰素，而安全性相似［３９］。在一项长效干扰素逡逑６逡逑

抗病毒,适应性,来源,图片

图１－２．邋ＨＢＶ感染过程中的适应性抗病毒应答逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２．邋Ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ邋ａｄａｐｔｉｖｅ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ＨＢＶ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑（图片来源？？邋Ｖｉｒｕｓｅｓ邋（２００９）邋１：邋９１－１０３邋）逡逑除，机体对ＨＢＶ特异性Ｔ淋巴细胞的免疫调节显得尤为重要。其中ＰＤ－ｌ，逡逑ＩＬ－１０，精氨酸酶，髓源抑制细胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ邋ｃｅｌｌｓ，邋ＭＤＳＣｓ）和逡逑调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｒ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ，邋Ｔｒｅｇ）在负调节发挥重要作用１５５＿５７］。在这些负调逡逑节细胞或分子的调控下，ＨＢＶ特异性Ｔ淋巴细胞数量减少，应答水平降低，同时逡逑记忆Ｔ细胞增加并可维持数十年［５８］。逡逑ＣＤ４＋邋和０0８＋丁细胞识别不同表位（ｃｏｒｅ，邋ｅ，ｅｎｖｅｌｏｐｅ，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ和ｘ）所逡逑产生的特异性效应细胞的数量有差异１５９４２１。识别优势表位更有助于研发相应的逡逑疫苗，从而增强Ｔ细胞应答，防止病毒变异逃逸。但与此相关的研究比较少，逡逑因为即使是频数最高的表位特异性的Ｔ细胞，尚不能等价于抗病毒效果最好的Ｔ逡逑细胞。人类Ｔ细胞表位非常复杂，同一人的ＣＤ８＋邋Ｔ细胞最多可以表达６种ＭＨＣ逡逑

HBV感染,免疫状态,年龄变化

第一章前言逡逑１．５慢性ＨＢＶ感染过程免疫应答与年龄关系逡逑如前所述，母婴传播是儿童慢性ＨＢＶ感染的首要病因。由于儿童慢性ＨＢＶ逡逑感染以免疫耐受为特点，并且在ＨＢＶ转基因小鼠的研宄中发现幼龄小鼠的Ｔ／Ｂ逡逑细胞分化成熟受抑制［８９］，因此既往认为ＨＢＶ是一种利用婴儿不成熟的免疫系统逡逑从而建立持续感染的典型病毒。但是随着研究进展发现，在胎儿早期，效应免逡逑疫应答和调节免疫应答已经可以被检测到；并且，新生儿对病毒感染可以建立逡逑病毒特异性的Ｔ细胞应答。流行病学研宄也发现ＨＢＶ阳性母亲所分娩的婴儿对逡逑ＨＢＶ疫苗的应答效率和健康对照组相似［％］；并且在疟疾－ＨＢＶ共感染的患儿中逡逑发现其血液原虫数量更少，但更易发生脑型疟疾（脑型疟疾是Ｔｈｌ型细胞介导的逡逑并发症）［９１］。总之这一结论正在经历挑战。逡逑

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