大样本成骨不全症基因型—表型关系及唑来膦酸对成骨不全症患儿椎体形态影响

发布时间：2020-10-08 19:07

　　 第一部分大样本成骨不全症基因型-表型关系目的:成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)是一种危害极其严重的常见单基因遗传性骨病,主要临床特点包括骨密度(bone mineral density,BMD)降低、骨脆性增高、反复脆性骨折和骨骼畸形。目前我国OI致病基因突变谱研究仍不完善,基因型-表型关系尚未完全明晰。本研究旨在前期研究基础上扩大样本量进一步探索OI致病基因突变谱,采用临床表型评分更精确评估表型信息,定量分析OI基因型-表型关系。方法:本研究纳入了2016年9月至2018年12月于北京协和医院内分泌科诊断为OI患者及本中心既往已行基因检测OI患者共380例。通过二代靶向测序技术检测患者致病突变并行Sanger测序验证。收集患者临床表型资料,包括病史、体格检查、血清生化指标、BMD和骨骼X线片,根据Sillence分型将患者分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅳ型。为更加精确评估患者临床表型轻重程度,对患者临床表型进行赋值评分,并对患者基因型-表型关系进行定量分析。结果:本研究共发现13种致病基因的239种不同突变,其中44种为目前尚未报道的新突变位点。Ⅰ型胶原编码基因(COL1A1和COL1A2)是OI患者最主要致病基因,占所有患者77.9%,其次为IFITM5(4.5%),而SERPINF1(2.1%)是OI最常见常染色体隐性遗传致病基因,其次依次为WNT1(1.6%)和FKBP10(1.6%),TMEM38B(1.1%)和PLOD2(1.1%),SERPINH1(0.3%)、BMP1(0.3%)和SEC24D(0.3%)。此外,还发现极为罕见常染色体显性遗传基因P4HB和X染色体显性遗传基因PLS3突变。不同Sillence分型患者致病基因突变谱亦存在差异。通过对OI患者基因型-表型关系定量分析,发现常染色体隐性遗传基因突变患者临床表型评分最高(14.8±5.6),其次为 IFITM5(12.8±5.0)和COL1A(11.6±4.9),COL1A1基因突变患者临床表型评分最低(9.6±4.8);Ⅰ型胶原α1链和α2链质量变异患者临床表型评分(12.9±5.7和11.8±4.8)较Ⅰ型胶原α1链数量变异患者(7.8±3.4)更高,出现牙本质发育不全(dentinogenesis imperfecta,DI)比例更高(33.3%和42.0%vs 3.9%),但出现蓝巩膜(blue sclera,BS)比例较低(91.5%和 88.5%vs 100.0%);当α1链G1y替换发生在三螺旋结构第79位氨基酸之前,则患者均有BS而无DI表现;α2链G1y替换位置与骨折次数(r=0.317,P=0.006)和骨折频率(r=0.255,P=0.027)正相关,与腰椎 BMDZ值(r=-0.290,P=0.011)、股骨颈 BMDZ值(r=-0.446,P0.001)、身高 Z 值(r=-0.249,P=0.030)和体重 Z 值(r=-0.301,P=0.008)负相关;α1链和α2链中G1y替换为Ser患者临床表型评分(13.6±5.7和12.8±5.1)均较G1y替换为Arg患者(8.0±4.0和9.6±3.2)更高。结论:本研究在更大样本OI患者中进一步丰富和更新了我国OI致病基因突变谱,促进了OI患者准确诊断和分型、发病机制研究和遗传咨询,也为将来OI分子靶向治疗开展提供基础。此外,本研究通过定量分析OI基因型-表型关系,发现致病基因种类、Ⅰ型胶原编码基因突变类型及G1y替换的氨基酸种类和位置均与患者临床表型存在关联,这对判断OI患者预后和指导临床药物治疗选择具有积极意义。第二部分 唑来膦酸对成骨不全症患儿椎体形态影响目的:椎体压缩性骨折(vertebral compression fracture,VCF)是成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)常见的严重并发症,但目前未得到充分重视和诊治。本研究旨在前瞻性地观察唑来膦酸(zoledronicacid,ZOL)治疗期间OI患儿椎体形态的变化,并评估椎体形态的影响因素。方法:纳入2014年10月至2018年3月在北京协和医院内分泌科诊为OI的儿童和青少年42名,经年龄和性别匹配,分为VCF和非VCF(non-VCF,NCVF)组。予ZOL(静脉注射,5mg/年)联合钙剂和维生素D治疗,随访2年。另外纳入17名初诊尚未接受治疗的有VCF的OI患儿作为初诊未治疗组,并将其与ZOL治疗后1年VCF组中的17名OI患儿(ZOL治疗组)进行年龄、性别、临床严重程度匹配。于治疗前后测量患者身高、体重,检测血清骨代谢指标。采用双能X线骨密度仪测量股骨颈(femur neck bone mineral density,FN-BMD)和腰椎骨密度(lumbar spine bone mineral density,LS-BMD)。拍摄胸腰椎侧位像,采用DICOM系统测量第四胸椎(T4)至第四腰椎(L4)椎体前缘(anteriorheight,ah)、后缘(posteriorheight,ph)、上缘中点至下缘中点(mid height,mh)、上缘(upper length,UL)、下缘(lower length,LL)及前缘中点至后缘中点(mid length,ML)径线长度,精确至0.1mm,并计算各椎体压缩指数(mh/ph)、高长比(ah/LL,mh/LL,ph/LL)和投射面积(projection area,PA)。结果:VCF组32例,NVCF组10例。治疗前,经年龄、性别和身高校正后,VCF组患儿PA、mh/ph、ah/LL、mh/LL和ph/LL均显著低于NVCF组(P0.01)。与基线相比,VCF组治疗1年后PA、mh/ph、ah/LL、mh/LL和ph/LL的均值分别提高了(35.2±19.5)%、(22.9±15.1)%、(19.6±13.9)%、(33.6±25.5)%和(8.1±8.8)%(均P0.01),治疗2年后PA、mh/ph、ah/LL、mh/LL和ph/LL的均值分别提高了(71.8±28.2)%、(42.8±21.8)%、(35.1±20.6)%、(65.4±43.2)%和(12.5±11.4)%(均P0.01)。ZOL治疗组mh/ph,ah/LL和mh/LL均值显著高于同年龄、同性别的初诊未治疗组(均P0.01)。多因素线性逐步回归分析显示,治疗前LS-BMD是PA(β=337.0,P=0.001)、mh/ph(β=0.866,P=0.015)、ah/LL(β=0.499,P=0.001)、mh/LL(β=0.492,P=0.005)和ph/LL(β=0.334,P0.001)独立相关因素。治疗 1年后LS-BMD增长率是PA(β=0.131,P=0.011)、mh/ph(β=0.127,P=0.002)、ah/LL(β=0.141,P=0.013)、mh/LL(β=0.209,P=0.002)和ph/LL(β=0.106,P=0.005)增长率独立相关因素。结论:OI患儿被压缩的椎体形态在ZOL治疗期间得到显著改善,治疗后PA显著增加,压缩椎体出现再塑形。低LS-BMD是VCF的独立危险因素,ZOL治疗后LS-BMD的增加是椎体再塑形主要决定因素。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R726.8
【部分图文】：

逦逡逑全血基因组ＤＮＡ提取试剂盒逦ＱＩＡＧＥＮ，德国逡逑无水乙醇逦北京化学试剂公司，中国逡逑ＡＭＰｕｒｅＫｉｔ邋（ＳＰＲＩ邋ＸＰ邋ｂｅａｄｓ）逦Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ，美国逡逑Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ邋Ｇｅｎｏｍｉｃ邋ＤＮＡ邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｐｒｅｐ邋Ｋｉｔ逦Ｉｌｌｕｍｉｎａ，美国逡逑Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ邋ＣｌｕｓｔｅｒＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ邋ｖ４逦Ｉｌｌｕｍｉｎａ，美国逡逑ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ邋序列捕获芯片（ＨＤ２）逦Ｒｏｃｈｅ邋Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，瑞士逡逑ＧｏＳｃｒｉｐｔＩＭ邋Ｒｅｖｅｒｓｅ邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ逦Ｐｒｏｍｅｇａ，美国逡逑ＰＣＲ引物合成逦北京天一辉远生物科技有限公司，中国逡逑２＞＜Ｔａｑ邋ＰＣＲ邋ＳｕｐｅｒＭｉｘ逦北京天一辉远生物科技有限公司，中国逡逑琼脂糖逦北京化学试剂公司，中国逡逑５0ｘＴＡＥ电泳溶液逦北京化学试剂公司，中国逡逑溴化乙锭（ＥＢ）逦北京化学试剂公司，中国逡逑ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００逦北京博迈德科技有限公司，中国逡逑２．２技术路线图：逡逑０１邋（邋ｎ＝３８０）逡逑

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２．１邋ＯＩ致病基因种类谱逡逑在３８０例０１患者中，３４９例经ＮＧＳ检测明确分子诊断，共检出１３种致病基因，逡逑２３９种不同突变，包括ＡＤ基因：ＣＯＺＬ４７突变患者１８８例，占４９．５°／。，ＣＯＺＬ４２突逡逑变患者１０８例，占２８．４％，／Ｆ／７Ｍ５突变患者１７例，占４．５％，尸４／／５突变患者２例，逡逑占邋０．６％；邋ＡＲ邋基因：ＳＭＰＭＦ７邋突变邋８邋例，占邋２．１％，奶ＶＴ７邋突变邋６邋例，占邋１．６％，逡逑突变６例，占１．６％，突变４例，占１．１％，ＰＺＯＤ２突变４例，占１．１％，逡逑ＳＭＶＭ／７突变１例，占０．３％，邋５ＭＰ／突变１例，占０．３％，证Ｃ２４Ｄ突变１例，占逡逑０．３％；邋ＸＬ基因：ＰＬＳ３突变３例，占０．８％邋（图１－５）。在２０１６年９月至２０１８年１２逡逑月就诊患者中又发现４４种目前尚未报道新突变位点（表１－８）。此外，２１种ＣＯＺＬ４ｉ逡逑２８逡逑

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