星形胶质细胞在幼鼠脑外伤血管新生中作用机制的初步体外研究

发布时间：2020-10-17 10:43

　　 创伤性疾病在现代社会已成为严重威胁儿童身体健康的疾病,并且发病率越来越高。脑外伤后新生血管的建立是儿童脑损伤后神经细胞再生的基础。星形胶质细胞在血管新生过程中发挥重要调控作用,但具体的分子机制尚不明确。因此对其进一步的研究将有助于我们了解星形胶质细胞在脑内血管新生中的确切作用机制。本研究通过诱导神经干细胞分化建立纯度极高的星形胶质细胞体外培养模型,并利用此方法培养的星形胶质细胞制作划伤模型来模仿在体状态下的脑外伤,然后提取其上清培养液用来培养脑的微血管内皮细胞,观察此培养条件下的内皮细胞形态,增殖及屏障特性的变化来了解儿童大脑损伤后星形胶质细胞在血管新生过程中发挥的作用。 第一部分 星形胶质细胞的纯化培养 目的利用神经干细胞可分化为星形胶质细胞的特性建立一种新的星形胶质细胞体外培养纯化的方法。 方法通过诱导原代培养的新生小鼠海马神经干细胞分化为星形胶质细胞,并运用差速贴壁和恒温摇床振荡的方法进行纯化,并且与经典的星形胶质细胞的培养方法进行了细胞形态,细胞标记分子,纯度,生长趋势和对损伤的反应等生物学特性的对比。应用SPSS15.0统计软件进行分析,所有计量资料以均数±标准差(X±s)表示。 结果经细胞免疫荧光实验证实,诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞进行的培养与纯化得到的星形胶质细胞的纯度可以达到99.4±0.5%,而传统方法得到的细胞纯度为94.2±2%,两种方法培养的星形胶质细胞的形态,细胞标记分子,纯度,生长趋势和对损伤的反应等生物学特性方面无明显差异。 小结诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的培养与纯化可以得到纯净的星形胶质细胞,与常规方法比较两种方法培养的细胞在生物学特性方面无明显差异并且此方法具有易制备易纯化的特点,因此可作为星形胶质细胞原代培养的一种新方法。 第二部分 划伤星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞增殖的影响 目的分别研究划伤和未划伤两种条件下的星形胶质细胞培养液对脑微血管内皮细胞形态,CCK-8增殖实验,毛细血管样管腔形成能力和跨内皮阻抗的测定的影响,初步探讨划伤星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞增殖的影响。 方法(1)实验分为两组：实验组为划伤星形胶质细胞条件培养液培养的脑微血管内皮细胞组；对照组为未划伤的星形胶质细胞条件培养液培养的脑微血管内皮细胞组；(2)采用CCK-8试剂盒检测两组细胞增殖状态的变化；观察两组细胞在Matrigel铺板的毛细血管样管腔形成能力；利用应用Millicell ERS系统在37℃恒温下检测两组的跨内皮电阻抗值(TEER)的变化。(3)应用SPSS15.0统计软件进行统计分析,所有计量数据以均数±标准差(X±s)表示。组间比较采用One-Way ANOVA进行单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。 结果(1)培养24小时候后,实验组细胞在不同时间点的吸光度值明显低于对照组,经统计分析P0.05,差异具有统计学意义。(2)在Matrigel包被的培养板中培养20小时两组内皮细胞观察毛细血管样管腔形成能力,实验组用划伤后1、3、7天的星形胶质细胞条件培养液培养20小时管腔样结构形成的个数为15.1±2.55；14.3±2.39；15.2±3.03；对照组在相应时间点上的毛细血管管腔样结构的个数分别为22.0±3.16；20.6±3.79；21.3±1.95；各时间点上的管腔样结构个数差异有统计学差异(P0.05),而同一组内不同时间点管腔样结构个数在第三天略有上升但差异无统计学意义(P0.05)(3)细胞培养24h测得的跨内皮电阻抗值分别在划伤后第1、3、7天的星形胶质细胞条件培养液培养的内皮细胞中每个时间点的TEER值(对照组分别为389±24.9；415±22.9；406±13.8；实验组分别为227±19.4；240±21.3；230±17.0)之间差异显著(P0.01),但每一组在不同时间点的TEER值变化不大,无统计学差异(P0.05)。 小结(1)实验组条件培养液培养的内皮细胞体积变小,形态仍呈梭形,折光性无明显改变。(2)实验组条件培养液可降低脑微血管内皮细胞的吸光度值和毛细血管管腔样结构形成的能力,并减弱了内皮细胞的屏障特性。 结论 1.诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的培养与纯化可以得到纯净的星形胶质细胞,此方法培养的星形胶质细胞在生物学特性方面与传统方法培养的细胞无明显差异并且此方法具有易制备易纯化的特点,因此可作为星形胶质细胞原代培养的一种新方法。 2.实验组条件培养液对脑微血管内皮细胞的形态影响不明显,但可明显减弱其增殖活性,毛细血管管腔样结构形成的能力和内皮细胞的屏障特性。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R726.5
【部分图文】：

图2星形胶质细胞免疫荧光染色A:对照纤王星)}么细J泡(KIOO，绿色为GFAP，蓝色为DAPI)B:‘士了}念夕目星)I于细)}f认3.不同时间点两组细胞计数:由表1可以看出，相同时间点诱导分化纤!.的细密度稍大，随培养时间的延长而增大，并目_由生长曲线和生长趋势两图表以看到两组细胞生长趋势二」卜常接近，两组统计分析所有时l’llJ点的P>0.05，差无统计学意义。表1星形胶质细胞生长情况的比较别细胞密度(104/ml)1天2大3天4天6天23.8士1.1838.4士1.5244.9士1.8365.25天士3.1774.5士1625.6士1.7240.2士12075.0士l，8nUn钊44曰l曰se45.4士1.4668.1士1.39
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 侯家骥，潘爱英，刘秀丽，刘秉钧;不同年龄大鼠大脑皮质损伤后的星形胶质细胞反应[J];神经解剖学杂志;1995年01期

2 杨如,杨雄里;高亲和力谷氨酸转运体[J];生理科学进展;2000年04期

3 周欣;明晓云;康颂建;白波;段耀奎;;差速贴壁技术对大鼠脑皮质星形胶质细胞纯化率的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年15期

本文编号：2844674