儿童胆汁淤积性肝病的基础与临床研究

发布时间：2020-10-18 14:20

　　 第一部分雌激素通过Notch信号通路调控肝母细胞向肝内胆管细胞分化及肝内胆管发育目的:研究雌激素通过Notch信号通路调控肝母细胞向肝内胆管细胞分化及胆管发育的机制。方法:(1)以流式细胞术从C57BL/6CrSlc胎鼠的肝脏提取DLK1阳性的肝母细胞,空白对照组不做任何处理,实验组分别用lnmol/L、10nmol/L、100nmol/L雌二醇干预24小时,雌二醇10nmol/L以及Notch信号通路阻断剂DAPT40umol/L干预24小时。以real time PCR方法定量检测Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、DLL4 的 mRNA;以激光共聚焦免疫荧光检测 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、DLL4 的蛋白表达水平;(2)空白对照组的肝母细胞不做任何处理,实验组用不同浓度的雌二醇(lnmol/L、10nmol/L、100nmol/L),或不同浓度的雌二醇联合 DAPT干预24小时,以流式细胞术检测SOX9及OPN双阳性的细胞百分比,观察雌激素对肝母细胞向肝内胆管上皮细胞分化的影响;(3)体内实验中,将C57BL/6CrSlc孕鼠随机分为空白对照组、雌二醇组、雌二醇+DAPT组和他莫昔芬组,空白对照组不作任何处理,雌二醇组孕6天起腹腔注射雌二醇0.6mg/kg.d,雌二醇+DAPT组孕6天起腹腔注射雌二醇0.6mg/kg.d,联合皮下注射DAPT 10mg/kg.d,他莫昔芬组使用他莫昔芬灌胃,剂量为0.4mg/kg.d。分别取孕第14、18天胎鼠及新生小鼠肝脏进行检测,以real time PCR法检测Notch1、Notch2、Jagged1的mRNA水平,免疫组化法检测Notch1、Notch2、Jagged1的蛋白表达水平,并采用HE染色法观察新生小鼠肝内胆管发育情况。结果:(1)体内及体外实验证实雌激素可以剂量依赖性地促进肝母细胞Notch信号通路中 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、DLL4 的 mRNA 转录及蛋白表达;(2)雌激素促进肝母细胞向肝内胆管细胞分化;(3)体内实验证实雌激素可以激活胎鼠肝脏Notch信号通路,并促进胎鼠肝内胆管发育。结论:雌激素可促进Notch信号通路活化,促进小鼠肝母细胞向肝内胆管细胞分化及肝内胆管的发育。第二部分 钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白缺陷患儿的临床研究目的:NTCP(Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide)缺陷近年来成为研究热点,该疾病患者被认为具有临床症状轻,肝功能受损轻的特点。然而,关于NTCP缺陷患儿的肝脏病理改变特点尚无相关报道。本文通过对13例NTCP缺陷患儿的临床表现、实验室检查、影像学检查及肝脏病理改变特点等进行综合评估,为临床工作中对该病的诊断和治疗等提供理论依据。方法:本研究提取2012年8月到2018年10月入住我院儿科的13例NTCP缺陷患儿的临床数据,进行回顾性分析。结果:13例NTCP缺陷患儿(男/女为2.25:1,1个月到5.5岁,平均年龄为1.36岁)均存在SLC10A1基因突变。所有患儿发育正常。8例患儿(8/13)表现出肉眼可见的黄疸,12例患儿(12/13)有高胆红素血症。共有11例患儿进行了肝脏穿刺检查,肝脏病理改变主要表现为轻度的慢性炎症。一例患儿(1/13)合并泥沙样胆结石。结论:(1)对于临床症状轻微,通过体检等偶然发现的高胆汁酸血症患儿,应考虑NTCP缺陷的可能,进行SLC10A1基因的筛查;(2)对于胆汁淤积性肝病的患儿,应考虑NTCP缺陷的可能,进行SLC10A1基因的筛查;(3)对于不明原因胆结石的患儿,应考虑NTCP缺陷的可能,进行SLC10A1基因的筛查。第三部分 胆道闭锁与非胆道闭锁性肝内胆汁淤积症诊断方法的评估目的:胆道闭锁与非胆道闭锁性肝内胆汁淤积症有多种鉴别诊断方法,本文对不同的诊断方法进行评估,为临床上快速、早期和准确的鉴别诊断提供理论依据。方法:本研究回顾性分析了自2007年5月至201 1年6月收治我院儿童感染消化专科的396例阻塞性黄疸婴儿。对所有患者进行肝功能检测、腹部彩超及十二指肠引流液检查。部分患儿行肝胆核素扫描、磁共振胰胆管造影及经皮肝脏穿刺检查。胆道闭锁的诊断以术中胆管造影及肝脏组织病理学检查为准。对不同诊断方法进行准确性、敏感性、特异性、阳性预测价值和阴性预测价值的评估。结果:178例患者(男性患儿108例,女性患儿70例;平均年龄为58 ± 30天)诊断为胆道闭锁。218例患者(男性患儿136例,女性患儿82例;平均年龄为61±24天)诊断为非胆道闭锁肝内胆汁淤积症。胆道闭锁与非胆道闭锁肝内胆汁淤积症的鉴别诊断方法中,临床表现、肝脏肿大、大便颜色、血谷氨酰转肽酶、十二指肠引流液颜色、十二指肠引流液胆汁酸浓度、超声检查胆囊大小、超声检查门脉区高回声区、核素肝胆动态显像、磁共振胰胆管造影及肝脏活检的准确性分别是76.0%、51.8%、84.3%、70.0%、92.4%、98.0%、90.4%、67.2%、85.3%、83.2%和 96.6%,敏感性分别是 83.1%、87.6%、96.1%、73.7%、90.4%、100%、92.7%、27.5%、100%、89.0%和 97.4%,特异性分别是 70.2%、77.5%、74.8%、67.0%、94.0%、96.3%、88.5%、99.5%、73.3%、75.4%和 94.3%,阳性预测值分别是 69.0%、72.6%、75.7%、64.6%、92.5%、95.7%、86.8%、98.0%、75.4%、82.6%和 98.0%,阴性预测值分别是 83.6%、8.5%、95.9%、75.7%、92.3%、100%、84.2%、93.7%、100%、84.0%和 92.6%。结论:胆道闭锁与非胆道闭锁肝内胆汁淤积症的每一种鉴别诊断方法在临床上都有其使用价值。十二指肠引流液的颜色及成分检查快速、准确,在以上鉴别诊断中临床实用价值高。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.7
【部分图文】：

图 1 雌激素促进肝母细胞 Notch 信号通路受体蛋白的表达 体外实验中，雌激素可以剂量依赖性地促进肝母细胞中 Notch1（图 1-左上）、Notch2（图 1-右上）、Notch3（图 1-左下）及 Notch4（图 1-右下）蛋白的表达；雌二醇 10nmol/L+ DAPT（40μmol/L）组与雌二醇 10nmol/L 组相比，受体蛋白表达水平下降，提示 Notch通路阻断剂 DAPT 可以部分逆转雌激素对 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 蛋白表达的促进作用。2. 雌激素可以促进肝母细胞 Notch 信号通路配体 Jagged1、DLL4 的表达流式细胞术分选 DLK1 阳性的肝母细胞，对照组不作任何处理，实验组分别用二醇 1nmol/L、雌二醇 10nmol/L、雌二醇 100nmol/L、雌二醇 10nmol/L+ DAP（40μmol/L），干预 24h。干预完成后，收获细胞，以激光共聚焦免疫荧光方法检测种 Notch 配体的蛋白表达水平。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文流式细胞术分选 DLK1 阳性的肝母细胞，对照组不作任何处理，实验组 1nmol/L、雌二醇 10nmol/L、雌二醇 100nmol/L 及雌二醇 10nmol/Lμmol/L）干预 24h。干预完成后，收获细胞，以 real time PCR 检测 Notc种受体及两种配体的 mRNA 水平。

29图 4 雌激素促进肝母细胞向肝内胆管细胞分化 体外实验中，雌激素呈剂量依赖性地促进肝母细胞向肝内胆管细胞分化。联用 Notch 信号通路阻断剂 DAPT（40umol/L）后，雌激素促进肝母细胞向肝内胆管细胞分化的作用被抑制。* p<0.05
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本文编号：2846409