研究背景毛细支气管炎(bronchiliotis)是由病毒感染引起的小细支气管及其周围组织的炎症,根据不同的指南,其发病年龄从6个月到24个月不等,该病发病率在生后第一年可达20%～30%。临床上,毛细支气管炎的特点是呼吸困难、咳嗽、过度充气、三凹征、哮鸣音或喘息。然而毛细支气管炎是一种定义不明确且高度异质性的疾病,其临床表现、感染年龄、诱发因素以及潜在遗传机制存在差异。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和鼻病毒(rhinovirus,RV)是引起毛细支气管炎发病的主要致病因子,而80%及以上的毛细支气管炎为RSV感染引发,几乎2岁之前所有儿童都感染过RSV。该类病毒感染机体可长期作用于气道,并引发日后气道高反应及喘息发作。早期患有毛细支气管炎的儿童日后会增加哮喘的发病,部分队列研究表明该发病的比例可高达30%～40%。如果毛细支气管炎的致病因子是RSV,那么儿童发生哮喘的风险会增加2-3倍。因此,RSV感染引起的毛细支气管炎是后续哮喘发生的主要独立危险因素,但其致病机制仍不清楚。支气管哮喘的特征是气道慢性炎症、气道重塑和气道高反应性,是由多种宿主与环境因素相互作用引起的,目前治疗哮喘的主要药物为糖皮质激素,由于激素长期应用及远期副作用,不仅造成治疗的依从性下降,而且增加了哮喘儿童及其家庭的心理负担和经济负担。毛细支气管炎同样引起气道炎症及气道高反应性,且二者均存在Th1/Th2、Treg/Th17失衡,与哮喘存在类似的免疫功能紊乱。RSV目前被认为是引发儿童后期喘息的早期标志物。因此,更好地了解病毒感染的个人及环境因素可能是预防日后喘息发作的新策略,并可能会降低日后哮喘发生的风险。目前临床上针对毛细支气管炎的治疗仍存在争议,尚无有效及特异治疗药物,国际共识及国内指南中较一致的是均不建议使用皮质类固醇激素或抗生素。帕利珠单抗是一种针对RSV的单克隆抗体,早期预防接种能降低严重RSV感染,减少早产儿6年随访中的复发性喘息,但其不会影响日后哮喘的发病率。因此,寻找一种有效调节免疫功能并副作用小的治疗毛细支气管炎的药物势在必行。现研究表明,间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSCs)具有修复和免疫调节特性,已成为潜在的细胞疗法,并在某些肺部疾病、神经系统疾病中得到临床应用。人胎盘间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells,hPMSCs)相对其他MSCs更易获得,更容易诱导免疫耐受,更接近于临床。关于hPMSCs是否可以用于毛细支气管炎患儿的临床治疗,及如何发挥调节免疫功能作用,并减少日后哮喘的发病,目前尚未见相关报道。Notch信号通路是一种高度保守的信号通路,在CD4+T细胞的分化过程中发挥重要作用。Notch信号的受体与配体结合后可相互作用,从而调控Th细胞因子的产生和极化。动物实验研究表明,阻断Notch信号通路后可缓解RSV毛细支气管炎大鼠气道炎症,减轻Th1/Th2细胞失衡。有研究表明,hPMSCs对Notch信号的表达起到重要的免疫调控作用。基于此,我们认为hPMSCs可能通过调节Notch信号的表达来调控毛细支气管炎大鼠的发病,可是hPMSCs参与毛支发病的机制和具体效应有待深入研究。本研究通过临床及基础研究两部分内容,来评估不同程度RSV毛细支气管炎患儿免疫功能紊乱及对日后喘息发生的影响,并评价hPMSCs移植后对大鼠毛细支气管炎模型Th细胞平衡、Notch信号通路的影响,探讨hPMSCs调节RSV毛细支气管炎免疫功能的分子学机制,为毛细支气管炎寻找新的临床治疗方法提供理论依据。第一部分不同严重程度RSV毛细支气管炎患儿免疫失衡及对日后哮喘发生的影响目的 比较健康儿童与不同严重程度RSV毛细支气管炎患儿急性期外周血CD4+T细胞亚群Th1、Th2、Treg、Th17细胞百分比及相关细胞因子水平,随访RSV毛细支气管炎患儿4岁龄时哮喘的发生情况以及外周血Th1、Th2细胞因子、IgE水平变化,了解不同严重程度RSV毛细支气管炎患儿体内免疫失衡状态及对日后哮喘发生的影响。方法 选取RSV 阳性毛细支气管炎患儿68例,正常对照组30例。其中轻度毛细支气管炎组32例,中重度毛细支气管炎组36例。采用流式细胞术方法(FCM)检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th1、Th2、Treg、Th17细胞所占CD4+T细胞比例,酶联免疫吸附法(ELISA)检测相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17水平。随后采用哮喘调查表、电话、来院复查相结合的方式进行随访,记录轻度组、中重度组毛细支气管炎患儿4岁龄哮喘的发病情况。采用ELISA方法检测两组随访组患儿外周血血清中IFN-y、IL-4水平,化学发光法测定外周血血清中IgE水平。结果 1.相较于正常对照组,轻度毛细支气管炎组患儿Th1亚群细胞百分比、IFN-γ相对表达量明显降低(P0.05),Th2亚群细胞百分比、IL-4表达明显增加(P0.05);中重度毛细支气管炎组较轻度毛细支气管炎组Th1亚群细胞百分比、IFN-y相对表达量显著降低(P0.05),Th2亚群细胞百分比、IL-4表达量明显升高(P0.05)。2.轻度毛细支气管炎组较正常对照组PBMC中Treg细胞亚群百分比、IL-10明显下降(P0.05),Th17细胞亚群百分比、IL-17升高(P0.05);相较于轻度毛细支气管炎组,中重度毛细支气管炎组PBMC中Treg细胞亚群百分比、IL-10明显降低(P0.05),Th17细胞亚群百分比、IL-17水平升高(P0.05)。3.成功随访50例毛细支气管炎患儿,其中轻度毛细支气管炎后发生哮喘患儿2例,非哮喘患儿22例(轻度随访组共24例);中重度毛细支气管炎后哮喘患儿8例,非哮喘患儿18例(中重度随访组共26例),轻度随访组哮喘发病率与中重度随访组相比,差异有统计学意义(P0.05)。4.相较于正常对照组,轻度随访组、中重度随访组患儿血清中IFN-γ的表达水平有降低趋势,但均无统计学意义(P0.05)。相较于正常对照组,轻度随访组血清中IL-4的表达水平有升高趋势,但差异无统计学意义(P0.05),而中重度随访组血清IL-4的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。5.轻度随访组血清中IgE表达有上升趋势,但其表达值在正常范围内;而中重度随访组表达显著升高,其均值远远高于正常值,相较于轻度随访组血清IgE表达量明显增高(P0.05)。结论 1.毛细支气管炎患儿急性期存在Th1/Th2细胞失衡及相关细胞因子的改变;2.毛细支气管炎患儿急性期存在Treg/Th17细胞失衡及相关细胞因子的改变;3.毛细支气管炎患儿病情越严重,Th1/Th2、Treg/Th17细胞失衡越明显;4.RSV感染后可造成患儿的长期损伤,导致IL-4以及IgE的表达量升高;5.初诊时RSV毛细支气管炎病情严重程度与日后哮喘的发生风险可能相关。第二部分 毛细支气管炎大鼠Notch信号通路的变化及hPMSCs移植的影响目的 建立大鼠毛细支气管炎模型和hPMSCs干预模型,研究hPMSCs对呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎大鼠的影响及可能机制。方法 SD大鼠30只随机分为RSV毛细支气管炎组、hPMSCs移植组、正常对照组,培养并鉴定hPMSCs,利用RSV滴鼻诱导建立RSV毛细支气管炎大鼠模型,采用尾静脉注射hPMSCs建立hPMSCs干预模型,观察各组大鼠症状、气道炎症改变、气道高反应性、BALF细胞分类,检测肺组织Th1、Th2相关蛋白,血液、肺组织、淋巴液中Notch信号相关受体及配体在各组大鼠中的表达水平。结果 1.观察记录到正常对照组大鼠表现基本正常,RSV毛细支气管炎组及hPMSCs移植组大鼠在造模后均出现不同程度的毛细支气管炎样发作症状,在整个造模及药物干预过程中无大鼠死亡。2.HE染色显示支气管及肺泡结构在正常对照组大鼠的表现大致正常,RSV毛细支气管炎组支气管及血管周围炎症细胞广泛浸润;与RSV组比较,hPMSCs移植组炎症反应程度减轻。3.RSV毛细支气管炎组AHR、BALF细胞总数较正常对照组、hPMSCs移植组明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。4.与正常对照组小鼠相比,RSV毛细支气管炎组肺匀浆中T-bet的相对含量降低、GATA-3的相对含量升高(P0.05);与RSV毛细支气管炎组相比,hPMSCs移植组T-bet的相对含量升高、GATA-3的相对含量降低(P0.05)。5.RSV毛细支气管炎组相较于hPMSCs与正常对照组,肺组织中Notch1、Notch2、Jaddged1蛋白的表达显著升高(P0.05),Notch3、Delta4蛋白表达明显下降(P0.05)。6.hPMSCs移植组相较于RSV毛细支气管炎组,血液、肺组织、淋巴液中 Notch1、Notch2、Jaddged1mRNA 表达显著下调(P0.05),Notch3、Delta4mRNA表达明显下调(P0.05)。结论 1.毛细支气管炎大鼠模型及hPMSCs干预模型诱导成功;2.Notch信号参与了毛细支气管炎的发病;3.hPMSCs可能通过下调Notch信号的表达从而减轻毛细支气管炎的严重程度。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.6
【部分图文】：
毛细支气管炎各组外周血ＩＦＩＮ－丫、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７的变化??上述流式细胞学检测结果己表明毛细支气管炎发病时存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２、??ｒｅｇ／Ｔｈｌ７细胞亚群比例失衡，众所周知，Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ及Ｔｈｌ７细胞的特细胞因子ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７的表达在其免疫学调节方面发挥重要。因此，我们又利用ＥＬＩＳＡ法检测了其特异性细胞因子（ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０－１７）的表达，进一步证实外周血中Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ、Ｔｈｌ７细胞的表达水果显示（见图２）：??各组中ＩＦＮ－ｙ因子结果表达趋势与各组中Ｔｈｌ细胞亚群百分比表达趋势相：相较于正常对照组，轻度毛细支气管炎组ＩＦＮ－Ｙ的相对表达量降低（１３．１７±２．ｌ５．８２±１．３２ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）；相较于轻度毛细支气管炎组，中重度毛细支炎组?ＩＦＮ－丫表达下降（９．０８±０．８９ｗｌ３．１７±２．０１ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）。??各组中ＩＬ－４因子结果表达趋势与各组中Ｔｈ２细胞亚群百分比表达趋势相－
山东大学博士学位论文???较轻度毛细支气管炎组降低Ｐ＜０．０５）。??各组中ＩＬ－１７因子结果表达趋势与各组中Ｔｈｌ７细胞亚群百分比表达趋势相??：相较于正常对照组，轻度毛细支气管炎组ＩＬ－１７含量升高（４０．７６±３．２８ｗ??±４．３７ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）；中重度毛细支气管炎组ＩＬ－１７表达较轻度毛细支气??组升高（４８．３８±５＿１６ｗ４０．７６±３．２８ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）。??１８０－１??
较于中重度毛细支气管炎组，中重度随访组患儿血清中ＩＦＮ－ｙ的表达１４．６９±２．８１?ｗ?９．０８±０．８９ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５），ＩＬ－４?的表达明显降低（８７．７２±８．３７±１３．５７ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５），见图?３－２。??１４０??Ｅ?１２０－??Ｔ??Ｓ?１００?ｍＬ｜?＊??１?８〇＂?１??１?６〇￣?■?＿中顧毛翅??＇土?４〇－．?■中重度随访组??§２０?－?—??〇??????＾…???ＩＦＮ－ｙ?ＩＬ－４??图３－２中重度毛支组及中重度随访组ＩＦＮ－ｖ、ＩＬ－４水平比较??注：＊Ｐ＜０．０５?ｉ／ｓ中重度毛支组??
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本文编号：
2850108
