Tbx1基因表达调节斑马鱼神经嵴细胞的发育及其与视黄酸信号的关系
发布时间：2020-11-03 00:34
DiGeorge综合征(DGS)是人类最常见的染色体缺失综合征之一,活产婴儿发病率约1/4000-5000。由于DGS累及组织器官较多,对患者的危害较大,特别是复杂心血管畸形,严重影响患者的生活质量和生命安全。因此,研究DGS的发病机理,探索预防策略十分重要。 近年来研究表明,DGS的发生与tbxl基因单倍剂量不足(haploinsufficiency)、神经嵴细胞(Neural crest cells, NCCs)发育异常等多种因素有关。鉴于此,我们研究了两者之间的关系。NCCs中tbxl基因不表达,可能存在介导tbxl基因作用的因子。 视黄酸(Retinoic acid, RA)是胚胎发育过程中必需的微量营养素,也是一种作用广泛的信号分子,与心脏发育的多个阶段有关。动物实验证实,RA缺乏会造成心血管系统发育异常,与DGS特征相似。 为此,我们考虑RA是否为tbxl基因表达与NCCs发育之间的“桥梁”?我们以斑马鱼为模式生物,研究了tbxl基因表达对NCCs发育的影响,并探讨RA在其中所起的作用。 为了模拟DGS患者tbxl基因单倍剂量不足,在第一部分,我们首先构建了tbxl基因表达下调的斑马鱼模型。通过显微注射特异性的tbxl基因反义寡核苷酸tbxl-MO,下调tbxl基因表达,导致斑马鱼表型异常,表现为心脏环化障碍、心包水肿、下颌骨减小、耳囊减小、眼睛减小。通过tbxl-MO效率验证,证实tbxl基因表达下调成功。 在tbxl基因表达下调的模型中,我们研究NCCs的发育过程。选取NCCs不同发育阶段的标记基因,通过胚胎整体原位杂交的方法,发现NCCs的起始、剥离、迁移、分化等多个发育环节都受到了tbxl基因表达下调的影响,发育过程受到抑制,心脏神经嵴细胞(Cardiac neural crest cells, CNCCs)向心脏细胞的分化障碍。 在第二部分,我们构建了RA缺乏的斑马鱼模型。通过显微注射视黄醛脱氢酶基因(raldh2)的反义寡核苷酸,下调raldh2基因表达,并通过效率验证,证实raldh2基因表达下调成功。Raldh2基因表达下调的斑马鱼,表型异常,表现为心脏环化障碍,心包水肿、体长短。而且我们发现,NCCs的起始、剥离、迁移与分化过程也受到了抑制,CNCCs向心脏细胞分化障碍。 鉴于tbxl基因表达下调与raldh2基因表达下调,NCCs发育抑制的表现非常相似,在第三部分,我们研究了tbxl基因表达与RA信号分子之间的关系。 通过原位杂交和real-time PCR的检测,我们发现,tbxl基因表达下调的斑马鱼中,RA合成酶基因-raldh2表达降低,而RA降解酶基因-cyp26al,cyp26b1, cyp26c1表达增强,说明tbxl基因表达下调可以从合成和降解两方面降低斑马鱼体内RA的水平。 我们在体外人工合成斑马鱼raldh2mRNA,对tbxl基因表达下调的斑马鱼进行拯救。实验证明,外源raldh2基因可以拯救tbxl基因表达下调的结果,异常的斑马鱼表型以及NCCs标记基因的表达都大部分得到拯救。因此,我们得出结论,RA是介导tbxl基因对NCCs发育调节的“中间桥梁”,tbxl基因表达通过RA来调节NCCs的发育。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R725.9
【部分图文】：
复旦大学博士学位论文 第一部分2.2 tbxl-MO的效率验证将浓度为0.052 的tbxl-pEGFP N1重组质粒单独显微注射入WT斑马鱼胚胎（n=50，重复2次），12 hpf，在劳光显微镜下可观察到明显的绿色焚光(图I-2A)。重组质粒与tbxl-MO共同注射的胚胎（n=50，重复2次），12 hpf,在劳光显微镜下几乎检测不到绿色突光（图I-2B)。以上结果证实tbxl-MO可以特异抑制斑马鱼tbxl基因的表达，即验证了 tbxl-MO下调基因表达的特异性和有效性。
图1-4 tbxl基因表达下调导致crestin基因表达降低。背面观。16马鱼中，NCCs已形成明显的迁移流，幵始向咽弓迁移，crestin所条NCCs迁移流清晰可见，如星号所示（A)，在tm斑马鱼中，N移中的NCCs中表达明显降低，其所标记的三条迁移流几乎消失，示（B)。19.5 hpf与24 hpf tm斑马鱼中crestin的表达较wt组明显其是在颇部，如箭头所示（C-F)。Figure 1-4 crestin was down-regulated in tbxl-kd zebrafish. Dorsal viewt zebrafish showed three migratory streams located by crestin, as sasterisks (A), 16 hpf, tm zebrafish showed reduced migratory streams,with arrow (B). At 19.5 hpf and 24 hpf, the reduced expression of crpersisted in tm zebrafish (C-F).2 tfap2a基因表达水平在tbxl-kd组斑马鱼中明显降低
旦大学博士学位论文 部NCCs中表达明显降低，NCCs迁移流不清晰，而在躯干NCCs中的（图 I-5B)。19.5 hpf，WT组中，可见tfap2cx基因在中、后脑两侧迁移中的NC烈的表达（图I-5C),而在tbxl-kd组中，tfap2a基因在相同区域的表达降低（图I-5D)。24 hpf, WT组斑马鱼中，tfap2a基因很清晰地表达于后脑的菱脑5E),而在tbxl-kd组中，其在菱脑节的表达显著减低，几乎消失（图tbxl-rescued斑马鱼中，tfap2a基因表达与WT组中相似（图1-7 B)。我们发现，tbxl基因下调引起tfap2a基因在迁移中的NCCs的表达水crestin基因表达的改变相似，更说明在ttod-kd组斑马鱼中，NCCs的了抑制。A
【参考文献】
本文编号：2867816
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R725.9
【部分图文】：
复旦大学博士学位论文 第一部分2.2 tbxl-MO的效率验证将浓度为0.052 的tbxl-pEGFP N1重组质粒单独显微注射入WT斑马鱼胚胎（n=50，重复2次），12 hpf，在劳光显微镜下可观察到明显的绿色焚光(图I-2A)。重组质粒与tbxl-MO共同注射的胚胎（n=50，重复2次），12 hpf,在劳光显微镜下几乎检测不到绿色突光（图I-2B)。以上结果证实tbxl-MO可以特异抑制斑马鱼tbxl基因的表达，即验证了 tbxl-MO下调基因表达的特异性和有效性。
图1-4 tbxl基因表达下调导致crestin基因表达降低。背面观。16马鱼中，NCCs已形成明显的迁移流，幵始向咽弓迁移，crestin所条NCCs迁移流清晰可见，如星号所示（A)，在tm斑马鱼中，N移中的NCCs中表达明显降低，其所标记的三条迁移流几乎消失，示（B)。19.5 hpf与24 hpf tm斑马鱼中crestin的表达较wt组明显其是在颇部，如箭头所示（C-F)。Figure 1-4 crestin was down-regulated in tbxl-kd zebrafish. Dorsal viewt zebrafish showed three migratory streams located by crestin, as sasterisks (A), 16 hpf, tm zebrafish showed reduced migratory streams,with arrow (B). At 19.5 hpf and 24 hpf, the reduced expression of crpersisted in tm zebrafish (C-F).2 tfap2a基因表达水平在tbxl-kd组斑马鱼中明显降低
旦大学博士学位论文 部NCCs中表达明显降低，NCCs迁移流不清晰，而在躯干NCCs中的（图 I-5B)。19.5 hpf，WT组中，可见tfap2cx基因在中、后脑两侧迁移中的NC烈的表达（图I-5C),而在tbxl-kd组中，tfap2a基因在相同区域的表达降低（图I-5D)。24 hpf, WT组斑马鱼中，tfap2a基因很清晰地表达于后脑的菱脑5E),而在tbxl-kd组中，其在菱脑节的表达显著减低，几乎消失（图tbxl-rescued斑马鱼中，tfap2a基因表达与WT组中相似（图1-7 B)。我们发现，tbxl基因下调引起tfap2a基因在迁移中的NCCs的表达水crestin基因表达的改变相似，更说明在ttod-kd组斑马鱼中，NCCs的了抑制。A
【参考文献】
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1 刘薇廷，宁寿葆，华邦杰，陈应泰，周世瑜，郭安玲，陈树宝，周爱卿，张子珊，周韦;上海市杨浦、徐汇区小儿先天性心脏病发病率及其特点[J];中华儿科杂志;1995年06期
本文编号：2867816
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/eklw/2867816.html
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