胰岛素样因子3对培养小鼠睾丸引带细胞的影响

发布时间：2020-11-08 14:01

　　 目的: 许多研究表明,男性生殖系统分化和发育异常明显增加,大多数与睾丸发育、下降不全相关,而睾丸引带与睾丸发育、下降关系密切。人类胰岛素样因子3(INSL3)基因广泛存在,其表达的蛋白多肽是胰岛素样家族激素的一部分,是睾丸经腹下降阶段的主要调节激素,对睾丸引带的发育起决定性作用。但到目前为止,关于INSL3影响睾丸引带发育的机制尚未研究清楚。本实验拟通过体外培养小鼠睾丸引带细胞,利用不同浓度INSL3直接作用于培养的小鼠睾丸引带细胞,研究INSL3对培养小鼠睾丸引带细胞增殖和收缩活性的影响,以探讨INSL3影响睾丸下降的可能机理。 方法: 脱颈椎处死3d大雄性昆明小鼠,消毒后正中剪开下腹部,再次辨认雌雄,在3倍手术放大镜下于膀胱两侧完整游离出睾丸、附睾及睾丸引带,置于PBS中剔出大部分睾丸引带组织。将引带组织放入含Ⅰ型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养液中,37℃持续震荡消化1小时后,加入3-4倍含无雌激素血清的培养液终止消化作用,1500r/min离心滤液5min,弃上清。将细胞沉淀加入含无雌激素胎牛血清(10%v/v)DMEM培养基,接种于25cm~2培养瓶中,置于5% CO_2、37℃饱和湿度孵育箱中静置培养。根据不同的检测要求,将贴壁的睾丸引带细胞以6×10~4/ml密度的细胞悬液(Ⅰ代细胞或者Ⅱ代细胞)分别传代接种到6孔板、96孔板以及培养瓶中,并用台盼蓝染色计数法确定细胞存活率,血清浓度为5%培养。细胞接种约24小时后,随机分为实验组(INSL3 0.02ng/ml、0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml)、正常对照组细胞。加药后,INSL3作用不同时间获取标本,分别采用HE染色、CCK-8、免疫荧光以及流式细胞分析术等方法检测小鼠睾丸引带细胞增殖以及F-actin的表达情况。 结果: 1.原代培养的小鼠睾丸引带细胞大部分为成纤维样细胞,有少数上皮样细胞生长,呈放射状、火焰状或漩涡状走行,胞体呈梭形、不规则形或三角形,胞质有突起。传代后细胞仍呈成纤维细胞型生长,同源性好,存活率约为90%。 2. CCK-8方法发现正常对照组细胞呈持续性增殖,于培养24h后增殖越趋明显。与正常对照组增殖趋势类似,实验组加药后12h即存在增殖(P0.05),但12h与24h相比差异不明显(P0.05),48h出现明显差异(P0.05)。与正常对照组相比,不同剂量组在12h无统计学差异(P0.05),而24h与48h情况则不同:24h时2.00ng/ml、20.00ng/ml组与正常对照组相比均有差异(P0.05),48h时0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml组与正常对照组相比均有显著差异,其余剂量组差异不明显(P0.05)。 3.免疫荧光显示正常对照组的F-actin主要分布在细胞周边,形成周边肌动蛋白丝带,胞浆内可见少量短而细的应力纤维。INSL3刺激引起细胞骨架重塑,细胞周边肌动蛋白丝带增多,且胞浆中微丝F-actin明显粗大、变长,大多为较长的粗大应力丝,沿细胞纵轴排列较多。在20.00ng/ml组变化尤其明显,呈一定的剂量和时间相关性。 4.流式细胞仪检测F-actin蛋白显示INSL3作用24h后0.02ng/ml、0.20ng/ml组平均荧光强度与正常对照组相比有所下降,均有统计学差异(P0.05),2.00ng/ml组与正常对照组相比无统计学差异(P0.05),20.00ng/ml组平均荧光强度明显高于正常对照组(P0.05);48h后20.00ng/ml组平均荧光强度明显高于正常对照组(P0.05),其余各剂量组与正常对照组相比无统计学差异。同一剂量组,48h与24h相比有下降趋势,其中0.02ng/ml组无统计学差异(P0.05),而0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml组均有差异(P0.05)。 结论: 1.培养小鼠睾丸引带细胞呈成纤维细胞型生长,传代后细胞同源性好,存活率高。 2. CCK-8检测结果显示INSL3对小鼠睾丸引带细胞增殖有显著的促进作用,呈剂量-时间效应。 3. F-actin的检测结果从形态学以及蛋白定量分析方面均提示INSL3可能通过增强小鼠睾丸引带细胞的收缩来影响睾丸引带的发育,进而影响睾丸的正常下降。
【学位单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R726.9
【部分图文】：

细胞低密度呈扁平单层细胞，细胞生长密度增加趋于融合时，细胞形态变得细长。大部分为成纤维细胞，有少数的上皮样细胞。细胞呈放射状、火焰状或漩涡状走行，胞体呈梭形、不规则形或三角形，胞质有突起。原代细胞培养约需 6～8d 达 80％融合时传代。传代培养：传代后细胞仍呈成纤维细胞型生长，同源性好。台盼蓝染色检测细胞存活率约为 90％。2 培养睾丸引带细胞形态学观察2.1 倒置显微镜观察睾丸引带细胞大部分为成纤维细胞，有少数的上皮样细胞。细胞呈放射状、火焰状或漩涡状走行，胞体呈梭形或不规则形或三角形，胞质有突起。原代原代、I 代和 II 代睾丸引带细胞在形态上无区别。

图 2 培养睾丸引带细胞 HE 染色结果 (A：×100；B：×200；C：×400)显示睾丸引带细胞大部分呈成纤维细胞型，具有高度的同源性。3 INSL3 对睾丸引带细胞增殖性的影响（CCK-8 法）不同剂量的 INSL3 作用后三个不同的时间段对细胞增殖性的检测结果如图 3 和表1。结果显示：正常对照组细胞呈持续性增殖，于培养 24h 后增殖越趋明显。与正常对照组增殖趋势类似，实验组加药后 12h 即存在增殖（P<0.05），但 12h 与 24h 相比差异不明显（P>0.05），48h 出现明显差异（P<0.05）。与正常组相比，不同剂量组在 12h 无统计学差异（P>0.05），而 24h 与 48h 情况则不同：24h 时 2.00ng/ml、20.00ng/ml 组与正常对照组相比均有差异（P<0.05），48h 时 0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml 组与正常对照组相比均有显著差异，其余剂量组差异不明显（P>0.05）。

Blank Control Normal Control 0.02ng/ml 0.20ng/ml 2.00ng/ml 20.00nh 0.0088±0.0018△△*0.0708±0.0147*0.0673±0.0095*0.0678±0.0092 0.0725±0.0038*0.0713±h 0.0003±0.0027△△0.1082±0.0315 0.1045±0.0110 0.1092±0.0208 0.0972±0.0146*0.1002±h 0.0022±0.0024△△0.1138±0.0102 0.1190±0.0152 0.1172±0.0217 0.1402±0.0107△0.1314±h 0.0000±0.0051△△0.2480±0.0344*0.3378±0.0473*0.4207±0.0227△△*0.5891±0.0272△△*0.6690±0药后同一时间段内各组与正常对照组的比较，△: P <0.05,△△: P <0.01；同一组别内各时4h 的比较, *: P <0.05。ompared with the Normal Control group at the same time, △ : P <0.05,△ △: P <0.01; compared wie same group, *: P <0.05.
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本文编号：2874881