Galpha13信号通路与Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程的关系

发布时间：2020-11-09 21:12

　　 心脏锥干部畸形是常见的复杂性先天性心脏病(先心病)，是导致儿童死亡的主要原因之一。近端流出道隔对锥干部的发育至关重要。细胞缝隙连接蛋白43(Connexin43，Cx43)基因敲除(Cx43KO)小鼠心脏锥干部发育畸形，流出道梗阻，生后即出现死亡，表明Cx43在心脏流出道发育过程中起着重要作用。Cx43是连接蛋白家族中的重要一员，作为一种重要的通讯连接，是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础。本课题组先前的研究发现Cx43KO小鼠心脏近端流出道隔心肌化过程异常，提示复杂的分子机制参与心脏流出道梗阻的发生。为此，本课题拟研究Cx43KO小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变，筛选可能导致Cx43KO小鼠心脏流出道梗阻的相关基因，进一步阐述Cx43KO小鼠心脏流出道梗阻的发病机制。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心脏发育心肌化过程中的形态学研究 研究目的 利用Cx43基因敲除小鼠模型，探讨Cx43基因敲除小鼠与野生型小鼠在心脏心肌化发育过程中的形态学差异。 材料与方法 成年2月龄Cx43基因敲除杂合子小鼠交配，选取ED11.5～ED15.5天的胎鼠以及新生小鼠为研究对象，根据基因型分为Cx43基因敲除纯合子(Cx43-／-)、杂合子(Cx43＋／-)及野生型(Cx43＋／＋)，采用PCR方法鉴定基因型。显微解剖及HE染色观察心脏结构；免疫组织化学法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA的表达。 结果 1．所有Cx43-／-小鼠出生后很快死亡，其心脏大体解剖上可见右室流出道圆锥部明显膨出。Cx43＋／-新生鼠心脏无明显异常。 2．组织切片HE染色显示，出生后很快死亡的Cx43-／-小鼠右室流出道圆锥部组织异常增生，小梁间囊明显，结构排列紊乱，流出道腔缩窄，右室壁心肌致密层的厚度较野生型明显变薄。Cx43＋／-新生鼠心脏无明显异常。 3．野生型胎鼠心脏近端流出道心内膜垫组织于ED11.5天开始有融合趋势，ED13.5天完成融合；心肌化过程从ED12.5天开始，ED15.5天完成。整个心肌化过程呈现心肌由流出道隔外侧向内侧的生长趋势。而在Cx43-／-胎鼠，α-SCA在近端流出道隔心内膜垫组织的表达减少，尤其是在ED13.5～ED15.5天为著，说明心肌化过程延迟。Cx43＋／-的变化不明显。 小结 1．Cx43-／-小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要表型特征。 2．Cx43-／-小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞。 第二部分Cx43基因敲除胎鼠心肌化过程中心脏流出道组织中基因表达谱的变化 研究目的 观察Cx43-／-小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变，筛选可能导致Cx43-／-小鼠流出道梗阻的相关基因。 材料与方法 以ED14.5天的Cx43-／-和Cx43＋／＋胎鼠心脏近端流出道部为研究材料，分别提取总RNA，逆转录成cDNA；并在体外转录为cRNA，同时进行生物素标记及片段化；再与Affymetrix 430 2.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后，应用相关生物信息软件分析基因表达情况。对芯片检测中发现的差异表达的4个Galpha13信号通路上的基因，在ED11.5～ED15.5期间用Realtime RT-PCR的方法进行验证。 结果 1．与Cx43＋／＋组相比较，Cx43-／-组中表达上调2倍以上的基因共有287个，表达下调2倍以上的基因有199个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期等主要生理过程。 2．进一步筛查发现，Galpha13信号通路上的多个基因在Cx43-／-组有明显变化。 3．Realtime RT-PCR验证其中的4个基因包括RhoA、Rac1、Calm1及Rock-1的变化，表明其变化趋势基本与基因芯片结果相同。 小结 1．Cx43基因敲除后可以引起多个基因的表达异常，其中包括与流出道发育密切相关的一些基因。 2．Cx43-／-胎鼠心脏流出道组织中Galpha13信号通路RhoA、Rac1、Calm1及Rock-1等基因的差异表达可能与其流出道梗阻的发生相关。 第三部分Rock-1在胎鼠心脏流出道隔的表达规律及其在Cx43基因敲除胎鼠心脏流出道隔表达的变化 研究目的 观察Rho相关卷曲蛋白激酶Rock-1在小鼠胚胎心脏流出道发育过程中的时空表达规律，探讨其在胚胎心脏流出道隔心肌化过程中的作用。 材料与方法 选用ED11.5至ED15.5天的Cx43＋／＋和Cx43-／-小鼠，用免疫组织化学方法和实时荧光定量PCR方法检测Rock-1在胚胎不同发育时期流出道部位的表达，比较分析两组胎鼠心脏流出道组织中该基因表达的差异。 结果 1．Rock-1蛋白的表达主要局限在胚胎心脏近端流出道隔组织中，其表达的部位随胎龄的变化与α-SCA有类似之处。实时荧光定量PCR方法显示Rock-1基因从ED11.5即开始在流出道组织中表达，以后在ED13.5～ED14.5表达量达到高峰。这与胚胎心脏近端流出道心肌化的高峰时间吻合。 2．在近端流出道隔心肌化的ED11.5～ED15.5时期，随着Cx43-／-组流出道隔心肌化过程的延迟，免疫组化和Realtime RT-PCR均显示该组Rock-1的表达从ED13.5开始较Cx43＋／＋组明显减少，并持续至ED15.5天。 小结 1．Rock-1在心脏流出道组织中的时空表达模式与以α-SCA标记的心肌化过程极为相似，提示其可能参与了心肌化过程。 2．Cx43-／-胎鼠Rock-1的表达量下降可能与其流出道隔的心肌化延迟有关。 总结 Cx43基因敲除纯合子小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞，提示Cx43在心肌化的发生过程中起着重要作用。利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43-／-胎鼠心脏近端流出道发育畸形有关的多个基因，其中Galpha13信号通路上相关基因的表达异常可能与Cx43-／-小鼠流出道梗阻的发生有关。而Rock-1基因在心肌化过程中可能发挥重要作用，其表达量的下调可能是Cx43-／-胎鼠心脏近端流出道隔心肌化延迟的原因之一。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R725.4
【部分图文】：

17.525PCR所需引物:参考以往文献设计117]，见图1一1和表1一1。W宜如OUSTarg的 ngv.的or MetGlyArg!Ie·cX条MU协泊心协浏6图1一 1Cx43KO小鼠基因敲除技术图注:正常小鼠Cx43基因编码区包含在exonZ内，编码区前有启动子;通过设计一个没有启动子的neo基因载体，将其导入小鼠的胚胎干细胞中;由于缺乏启动子，导致Cx43基因不表达。表1一 1Cx43KO小鼠基因型鉴定引物序列检测位点Cx43WT引物名称Cx43一5”Cx43一3’上下游引物序列(5’一3’)产物长度 CCCDACTCTCACCl人 TGTCTCC500bPACTI一l一 1GCCGCCTAGCTATCCCNeo一5’ GCTTGCCGAATATCATGGTGGACx43KOIkbCx43一3’ACTI一l一 1GCCGCCI… AGCl’ ATCCC

(Cx43+/+)位点的片段。引物Cx43一3’和引物Neo一5’扩增出一条约Ikb的基因敲除(cx43一八)位点的片段。仅有一条soobp的片段者为cx43+/+，仅有一条Ikb片段者为Cx43一八，两条都有者为杂合子(Cx43十产)。(见图1一2)M盯ker一/-+/++/-2kbIkb500bP图1一2新生小鼠基因型鉴定pCR产物电泳图注:PcR产物中含有 1kb和50obP片段的是cx43杂合了(+/一);只含有Ikb的是cx43基因敲除鼠(一八);只含有500bp的是野生型(+/+)。八、检测指标及方法显微解剖观察心脏的大体结构;常规HE染色做组织病理学检查;采用免疫组化ABC法测定横纹肌肌动蛋白a一SCA的表达。具体方法如下:1.HE染色:按常规方法进行。

几乎所有的Cx43一八小鼠出生后很快死亡。从大体解剖上我们可以看出，Cx43一八新生小鼠心脏的右室流出通段明显膨出:而_且由于流出道部分明显的膨出导致主、肺动脉较正常时的位置后移(图1一3)。Cx43杂合子新生鼠心脏无明显图1一3野生型和Cx43基因敲除纯合子新生小鼠心脏外观差别注:A、B分别为Cx4:3+/十(野生型)和Cx43一产(Cx43基因敲除纯合了)新生小鼠心脏。绿、黄色星号分别表示主、月巾动脉。(LA=左心房，队=右心房，Lv二左心室，RV二右心室，orT=右室流出道。Ba门00卜m)二、HE染色显示野生型和cx43一八新生小鼠心脏横切面各平面差别新生小鼠心脏不同层面横断血组织切片HE染色显示:出生后很快死一亡的Cx43一八小鼠右室流出道圆锥部组织异常增生，小梁间囊明显，结构排列紊乱，流出逆腔缩窄，右室壁心肌致密层的厚度较野生型明显变薄。主、肺动脉之间的夹角关系和野生型相比有所差异(图1一4)。Cx43杂合子新生鼠心脏无明显异常。三、免疫组化显示野生型和Cx43一八胎鼠各时间段近端流出道隔横纹肌肌动蛋白。一SCA的表达差异在野生型胎鼠心脏，其近端流出道心内膜垫组织于EDll.5开始有融合趋势
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本文编号：2876976