β ARKct脂质体对体外循环心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-11-13 03:30

　　 背景:先天性心脏病是儿童心外科手术中最主要的原因之一,发病率居高不下,近年来,发病率突破2‰,新生儿先心病的发病率高,约50%的危重患儿得不到及时治疗于1岁以内死亡,严重危害儿童的生命健康。越来越多复杂心血管疾病的患儿,经心外科手术得以延长生命、减轻病痛[1,2]。随着CPB(Cardiopulmonary Bypass,CPB)技术的不断改进,CPB在冠脉旁路移植等高难度高复杂的心外科手术中,发挥了积极有益的作用,心外科重症手术患者的手术死亡率明显下降,同时,CPB技术显著降低了重症手术的术后并发症,是心血管手术中不可替代的重要组成部分。CPB技术对心肌组织反复断血再灌注的操作特点,使得其在辅助心血管外科手术的同时,引起了不同程度的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion inury,MIRI),造成严重的心肌顺应性减低,甚至有些患者诱发心衰、恶性心律失常等严重凶险性并发症的发生[2,3,4,5]。随着临床技术的更新,低温心脏停搏液在临床得以广泛推广和应用,CPB后心肌组织缺血再灌注损伤的问题,得到了显著的改善,然而,CPB后心肌顺应性降低、心脏收缩功能障碍引起的射血分数降低等心功能受损现象,严重降低了手术疗效,给患儿造成了严重影响。CPB后约7%的成人可出现缺血性透壁性心梗,约10%的成人出现左室收缩功能障碍[6,7]。儿童的心肌组织结构与成熟心肌差别巨大,儿童心肌组织的肌原纤维发育不完全,心肌组织收缩能力较成年人差,未成熟心肌组织的室壁张力较成年人高,心脏的顺应性差,兴奋性高,依赖糖酵解供能,能量利用率低,对应激的适应能力也不如成熟心肌。CPB手术的患儿再灌注后,心肌损伤程度较成人严重。由于临床常用的心肌停搏液等心肌组织保护方法,其研发和设计主要针对成熟心肌,不适用于儿童心肌组织,未成熟心肌在能量产生利用及兴奋耦联等方面存在明显的区别[8,9]。因此,针对小儿未成熟心肌的特点,我们迫切寻求一种缓解CPB后未成熟心肌损伤的方法,旨在减少患儿术后并发症,切实增强手术疗效。以G蛋白耦联受体激酶2(G protein-coupled receptorkinase2,GRK2)为靶点的基因治疗在动物模型和体外细胞实验中均取得了许多成果,GRK2即β肾上腺素受体激酶 1(β-adrenergic receptor kinasel,βARK1),研究发现,抑制GRK2的表达能提高缺血缺氧心肌组织β AR的密度和敏感性[10],能够增强心肌组织的收缩能力,鉴于上述因素,其在心肌组织的缺血再灌注损伤中,发挥重要功效。β肾上腺素受体激酶抑制剂βARKct即GRK2阻断剂,能够通过调节心脏舒缩过程中相关蛋白和分子的表达[11],发挥保护心肌组织有效舒缩目的,在心肌组织缺血再灌注损伤中的研究前景广阔。将βARKct转染至人类心肌细胞能够增强心肌收缩功能,βARKct水平与缺血缺氧后心功能改善程度正相关[12,13]。课题组前期实验证实,以腺病毒为载体将βARKct转染至CPB猪心肌组织中,能够抑制GRK2的表达,增加βI-AR的密度,显著增强成熟心肌的心功能。然而,作为异种蛋白,机体对腺病毒会不同程度地产生细胞免疫,进而对腺病毒装载的基因治疗产生抵抗[14]。腺病毒载体心肌局部组织高浓度的应用,对注射部位心肌组织损伤严重,且腺病毒载体有潜在的致突变性[15],β ARKct对CPB后未成熟心肌组织的保护作用尚无报道。鉴于幼稚心肌的发育不全性,腺病毒对幼稚心肌组织局部损伤较成熟心肌更加严重,其潜在的致突变性对幼稚心肌的远期损伤不可估量;且作为生物载体,腺病毒制剂的储存运输方面的要求极为严格,临床推广有一定的局限性。我们试想,能否研发一种更加有效的药物载体,利用其缓释稳定的特性,减轻局部高浓度腺病毒对心肌组织的毒副作用,在尽可能发挥药物最大功效的同时,最大程度上降低药物的毒副作用,从而优化药物的治疗效应,同时,更加深入地探讨βA RKct心肌保护作用的机制。纳米脂质体(Lipid nanoparticles,LNPs)是一种双层的磷脂结构,能够分别在其内水相和双层磷脂膜之间包封亲水性和疏水性的药物。脂质体结构特殊,能够装载大量药物,众所周知,因为脂质体的理化性质比较稳定,作为常用的药物载体,其实验室研究及临床应用已经非常成熟[16,17]。然而,普通的脂质体在体内容易被清除,药物的有效血药浓度难以保障。对脂质体的研究中心发现,长循环纳米脂质体(Long Circulation Lipid nanoparticles,LC-LNPs),是一种经特定聚合物修饰的,在机体免疫方面具有较低免疫原性的复合脂质体,其载药安全性已被广泛研究,作为一种新型的药物载体,长循环纳米脂质体有独特的理化性质,特定聚合物与脂质体结合,在脂质体的表面,产生了一层特殊的化学性修饰保护膜,该保护膜为亲水性,亲水的特性,能够延长脂质体的体循环时程,降低血液清除率[17,18],其稳定性、长效性、高效性在基因载体中优越性明显,有较高的生物相容性及靶向性,能够切实保护所装载药物不被机体各种生物活性物质代谢,具有缓释、装载效率高等明显特征[19],是未来基因载体的重要研究方向。目的:1、研发长循环纳米脂质体复合物βARKct-CMD-LPNs,旨在避开生物载体的弊端,研发一种方便运输储藏的稳定载体,在最大程度上发挥药物生物学功效的情况下,尽量减少药物的用药量,尽最大努力减少目的药物对机体的毒副作用,以提高药物的药效,优化药物。2、研究βARKct-CMD-LPNs对CPB后幼稚猪心肌组织的保护作用,初步探讨其对幼稚心肌组织的保护作用作用机制。3、进行体外细胞培养,模仿体内心肌缺血缺氧的过程,通过多层面,多角度更加深入地探讨βARKct-CMD-LPNs对缺氧再复氧后大鼠心肌细胞具体保护作用及其作用机制。方法:首先构建普通脂质体,利用化学方法对构建的脂质体进行修饰,使其理化性质更加优越,利用先进的纳米技术,构建长循环,具有靶向载药功能的纳米脂质体复合物βARKct-CMD-LPNs。针对CPB后MIRI错综复杂的机制,构建猪体外循环CPB模型,观察纳米脂质体复合物βARKct-CMD-LPNs对CPB后未成熟猪血流动力学和心脏形态及功能方面的改善作用;通过CPB后血液指标及对心肌组织的实验室检查,初步分析βARKct-CMD-LPNs对CPB后幼稚猪心肌保护作用的原理。构建大鼠H9C2心肌细胞缺氧再复氧模型,通过体外细胞实验,进一步评价复合物βARKct-CMD-LPNs对大鼠H9C2心肌细胞的体外保护作用,同时,利用westernblot法对多种蛋白进行检测,将多条信号传导通路进行并行检测评估,多途径进一步深入分析,心肌组织缺血再灌注损伤的关键通路和损伤后的治疗靶点,以期为实现βARKct-CMD-LPNs从细胞水平分子机制到大动物模型的转化提供重要的事实依据和理论支撑。1、构建CMD-LPNs长循环纳米脂质体载体,通过将纳米技术与基因转染技术衔接,利用薄膜透析法,将聚合物葡聚糖与油胺发生化学反应,修饰到普通脂质体上,装载目的基因,合成具有特殊理化性质的βARKct-CMD-LPNs纳米脂质体复合物。用红外光谱、核磁共振、粒径大小及分布、Zeta电电位、透射电镜等方法对上述研发物进行表征,对其生物利用性能进行评估,成功研发出长循环纳米脂质体复合载体,更有利于目的基因的装载,在达到最大可能发挥药物生物学功效的同时,尽最大程度上减少目的药物的毒副作用,提高药物的药效。2、构建幼稚猪CPB模型,通过βARKct-CMD-LPNs处理,观察ARKct-CMD-LPNs对CPB后猪血流动力学和心脏形态及功能方面的改善作用,确认βARKct-CMD-LPNs对CPB后猪心脏的保护作用;通过βARKct-CMD-LPNs处理,分析CPB后猪血液及组织学指标,研究猪体内激素水平、心肌损伤程度、受体水平、能量通路的保护和改善作用;用RT-PCR和Western blot法在基因水平和蛋白水平共同探讨β AR的表达情况;评估βARKct-CMD-LPNs在凋亡通路、炎性通路、能量通路等方面的作用。3、按照要求,制作大鼠H9C2心肌细胞缺氧再复氧模型,造模成功后,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞法,检测心肌细胞凋亡率;Elisa法测LDH、TNF-α、IL-1、MDA、ROS、SOD等炎性因子及活性氧族的浓度,评估心肌细胞缺氧再复氧后的损伤程度,同时,评价各组心肌细胞脂质过氧化程度,研究各组心肌细胞清除氧自由基的能力;Western blot法评估凋亡相关蛋白β-Foxo1/Casβase3,自噬相关蛋白Foxo 1/LC的表达情况;评估GRK2、β-Foxo 1/Foxo 1蛋白表达量的关系。数据统计,综合分析,评估βARKct-CMD-LPNs对心肌组织细胞的保护作用及机制。通过对多种信号通路的分析,进一步明确βARKct-CMD-LPNs的保护机制,为实现βARKct-CMD-LPNs从细胞水平分子机制到大动物模型的转化提供重要的事实依据和理论支撑。结果:1、红外光谱、核磁共振、粒径电位、透射电镜等方法对βARKct-CMD-LPNs纳米脂质体复合物表征后发现,新构建的复合物理化性质明确,其红外吸收光谱在1680-1750cm处,可发现C=O特异性吸收波峰,我们推断,葡聚糖完成了羧基化反应。其电位约-20mV,CMD各分子层之间电负性,适度的静电排斥以及空间位阻效应,保证该复合物之间不易聚集,具有良好的物理稳定性。脂质体的粒径比较均一,呈正态分布趋势,大约在90nm左右,合成的脂质体测包封率基本能够大于90%,满足药典的基本要求。该复合物于低温冰箱中长期储存后发现其粒径及电位基本保持不变,且该复合物在血清中具备良好的稳定性。通过上述结果分析,我们认为所研发的βARKct-CMD-LPNs复合物成功,达到药典的要求。2、βARKct-CMD-LPNs复合物对CPB后猪心功能有保护作用。实验证实:βARKct-CMD-LPNs复合物预防性应用能够增加CPB后幼稚猪左室射血分数、左室容积,心功能的多项指标得到了显著改善。同时,βARKct-CMD-LPNs复合物预防性应用能够调控CPB后多项激素的分泌情况,维持能量代谢通路,增加β受体的密度和反应性,保护心肌组织,同时,能够减少凋亡的发生,保护心肌组织。H-E染色、电镜实验结果证实CPB后猪心肌组织及细胞结构发生了严重的损伤,大量心肌细胞凋亡;实验证明,通过预防性应用βARKct-CMD-LPNs复合物,CPB后猪心肌细胞的损伤情况明显缓解,凋亡细胞数量减少,心肌组织得到了切实有效的保护。免疫荧光染色、Western blot及RT-PCR法证实:CPB后血液中去甲肾上腺素分泌增加,猪心肌组织β1-AR、β2-AR数量减少,SERCA2a/RYR2表达减少,GRK2表达显著增加,βARKct-CMD-LPNs复合物预防性应用,血液中去甲肾上腺素分泌略降低,猪心肌组织β1-AR数量恢复,SERCA2a/RYR2表达增加,GRK2表达略下降。3、体外H9C2心肌细胞培养后,证明脂质体复合物的心肌保护作用,结果显示,缺氧再复氧后,损伤加重,心肌细胞炎性细胞因子的分泌较正常明显增多,心肌细胞损伤严重,βARKct-CMD-LPNs组心肌细胞炎性因子分泌少,心肌细胞损伤程度较轻。Western blot证明,缺血缺氧复氧组载体对照组、缺血缺氧复氧心肌细胞凋亡指标Caspase3、p-Foxo 1表达明显增加,βARKct-CMD-LPNs组Caspase3、p-Foxo1的表达较上述两组下调。与正常对照组相比,缺血缺氧复氧组载体对照组、缺血缺氧复氧心肌细胞自噬相关指标LC3-I1、Foxo1表达明显增加,βARKct-CMD-LPNs组LC3-Ⅱ、Foxo 1的表达较上述两组下调。结论:1、βARKct-CMD-LPNs纳米脂质体复合物的良好理化性质及血清稳定性的特征,有利于目的基因的装载,在达到最大可能发挥药物生物学功效的同时,尽可能降低药物的毒性作用,从而优化药物的治疗效应。该复合物的研发成功,为药物的装载提供了基因脂质体联合的新颖思路,其临床应用前景广阔。2、βARKct-CMD-LPNs预防性应用,可显著改善CPB后幼稚猪心脏功能各项指标,切实提高了心肌组织的舒缩功能,降低了过度凋亡的发生,对幼稚心肌细胞线粒体的形态和功能保护作用效果显著,同时,提高β1-AR的密度和敏感性,从而实现保护心肌组织的作用。3、实验证实,βARKct-CMD-LPNs复合物预防性应用,对大鼠源性H9C2心肌细胞缺氧再复氧模型的保护作用明显,多种实验结果证实,该复合物的心肌保护作用,通过多种信号通路发挥对幼稚心肌的保护作用。Foxo1对GRK2的转录有正向调控作用,βARKct-CMD-LPNs复合物可能通该调控作用发挥心肌细胞的保护功效。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R726.5
【部分图文】：

相关化学结构简式磷脂结构简式B:胆固醇结构简式C:两亲性CMD合成化学t

Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ?ＣＭＤ??图ｌ－ｌ相关化学结构简式??图１－１?Ａ：磷脂结构简式Ｂ：胆固醇结构简式Ｃ：两亲性ＣＭＤ合成化学反应式??，ｙｊ??．?１??ｙｂｅ＾．．??图１－２产物展示??图１－２八：白色絮状产物０＾１０；８：自左至右依次为？８５、蓝色混悬液０＾０－１＾阶、??ｐＡＲＫｃｔ－ＣＭＤ－ＬＰＮｓ。??２９??

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本文编号：2881660